建立培养

1.在盖玻片、载玻片（Ninc，Bellco)或皮氏培养皿上建立几份同样的单层培养。

2.在37°C条件下培养，直至细胞到达适合标记时。

加入核素

3.通常以0.1~10μCi/ml(约4.0KBq~0.4MBq/ml)、100Ci/mmol(约4GBq/pmol)的量加入核素，适合处理0.5~48h。

4.吸去全部含有核素的培养液，用BSS小心地清洗细胞，然后弃去培养液和洗液。

固定和处理细胞

5.用冰冷的乙酸甲醇间定细胞10min。

6.制片：

(a)盖玻片：用DPX或Permmmt将盖玻片封在载玻片上，细胞面向上。

(b)悬浮生长或胰蛋白酶消化后的细胞悬液：将细胞离心到玻片上或采用滴液制片。

(c)为了确定合适的曝光时间，多准备几张对照玻片，以便后面使用。从现在起所准备的玻片统称为“玻片”。

7.当标记DNA、RNA或蛋白质时，用冰冷的0.6mol/LTCA提取酸溶性的前体（10min，3次）。同时进行对照提取，如用脂性溶剂或酶消化。

8.用明胶溶液浸泡玻片2min。

9.垂直引流玻片上的液体后，使其晾干（这些玻片可在4°C条件下干燥储存)。

建立放射自显影

10.将玻片移入暗室。

11.在暗红色安全灯下，在46°C水浴箱将乳胶融化。

12.用1张干净的玻片轻轻地将乳胶混匀，注意不要产生气泡。

13.浸泡玻片：

(a)将玻片在46°C乳胶中浸泡5s，确认细胞被完全浸没。注意温度是至关重要的，将决定乳胶的厚度，并随之决定分辨率。

(b)取出玻片，引流乳胶5s。

(c)再将玻片用乳胶浸泡5s。

(d)取出玻片，垂直引流5s。

(e)用纸巾将每张玻片的背面揩干。

(f)将玻片平放在1张薄纸或滤纸片上10min，晾干。

(g)将玻片放在避光盒的格珊上，使其完全干燥。不要急于使玻片干燥，应在湿润的条件下慢慢晾干，以避免使乳胶脆弱。

14.玻片干燥约2~3h后，将其移入含有干燥剂如硅凝胶的避光显微切片盒中。保证不要触到玻片，并保证不要使玻片彼此接触或与干燥剂接触。

15.用黑色乙烯胶带将切片盒密封，再用黑纸或聚乙烯包裹，然后将切片盒放入冷藏箱。确认这个冷藏箱不用于储存核素。

16.将切片盒在4°C条件下放置1~2周。所需要的确切时间取决于样本的活性，这可通过间隔处理几张玻片来确定。玻片曝光时间过长时，背景加深和潜在的图像易于褪色。最好是增加标记活性而不使玻片曝光时间太长。

处理放射自显影细胞

17.将切片盒带回暗室，在暗红色安全灯下将密封带拆开。

18.使玻片恢复大气温度和湿度约2min。

19.准备20°C显影液（20%Phenisol（Ilford））。

20.将玻片在显影剂中放置2.5min，间隔地轻轻晃动。

21.用超纯水将玻片进行简短冲洗。

22.将玻片移入定影液（30%硫代硫酸钠）中，定影5min。

23.用去离子水浸洗后，将玻片放在硫代硫酸钠定影剂中，定影1min。

24.用冷的流水冲洗玻片，或通过5次换水将玻片清洗，5min以上。

25.待玻片干燥后，用显微镜进行观察。也可用相差显微镜观察置入水中的#00薄盖玻片。当观察完成时和在水干涸之前，将盖玻片取出，否则盖片将黏到乳胶上。

染色

26.用苏木精染色：

(a)在刚过滤的苏木精中将玻片染45s。

(b)将玻片在流水中清洗2min。

(c)在50%、70%和100%乙醇中逐级脱水。

(d)用组织透明剂透明玻片。用DPX封盖玻片。如果使用盖玻片，必须用#00盖玻片，并且用最少的封固剂，以便使100×物镜有足够的工作距离。

27.用Giemsa染色：

(a)将干燥的玻片浸入纯净的Giemsa染液中1min。

(b)用pH6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液将染液以1:10原位稀释10min。

(c)通过用水向上置换，除去染色液。不应将玻片取出或将染液倒掉，否则在染液顶部形成的浮渣将黏附在标本上。

(d)用流动的自来水彻底清洗玻片，直至颜色从乳胶中而不是细胞中除去。