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新一代等温扩增检测技术RPA介绍
一个月内,顶级学术期刊连发两篇顶级论文!上半年引爆生物圈的华人科学家张锋教授团队又有新动作!这次,他在一月内,分别在《Nature》、《Science》连发两篇论文!他将CRISPR-Cas13a改造成了灵敏度达到了阿摩尔级(aM,10的负18次方摩尔每升),可以检测单分子的SHERLOCK技术。而这其中,RPA起到了不小的作用。
那么,什么是RPA呢?
RPA,即重组酶聚合酶扩增技术,是在由多种酶和蛋白的参与下,在恒温条件下实现核酸指数扩增的技术,被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。
RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性,最佳反应温度在37°C左右。
RPA的反应原理
RPA的反应过程,首先是重组酶与引物结合,形成蛋白-DNA复合物。接着在dsDNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。而被替换的DNA链与SSB(单链DNA结合蛋白)结合,防止进一步被替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快,一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
RPA与相关技术的比较
与PCR实验相比,RPA实验能在恒定温度下进行全程实验,没有复杂的操作,对仪器及人员的要求不高,适合基层或现场快速诊断。
而另一种新兴技术,LAMP(Loop-mediatedisothermalamplification),中文名为“环介导等温扩增反应”,由于其简便的操作,也被视为PCR技术强有力的竞争者。在此,让我们对比下LAMP与RPA两种试剂盒进行的实验:
RPA试剂盒 | ||
主要组分 | 链置换DNA聚合酶 | 重组酶;单链结合蛋白;链置换DNA聚合酶 |
最适反应温度 | 60-65℃ | 37-40℃ |
推荐反应时间 | 40min左右 | 20min左右 |
引物数 | 2对 | 1对 |
保存形式 | 液体 | 冻干粉;液体 |
检测方式 | 荧光目视;比浊法实时浊度仪 | 电泳;试纸条;荧光定量 |
扩增产物可否用于下游应用 | 否 | 是 |
可否Multiplex/多重反应 | 否 | 是 |
缺点 | 气溶胶,易产生假阳性 | 价格高 |
英国TwistDx公司(前身为ASM科技有限公司)成立于1999年,基于英国剑桥Babraham研究院建立的生物技术公司。该公司通过突破等温DNA扩增,开发的重组酶聚合酶扩增专利技术(RPA),被誉为DNA诊断领域的革命性创新。
TwistDx以此技术为基础生产的核酸扩增类产品,能在恒定且较低的温度下,仅用10~20分钟,进行单分子核酸检测。这一技术对环境、硬件设施的要求很低,对于生物防护、水体检验、食品检验、医疗诊断、微流体、兽医等方面都有良好的应用。
RPA扩增的各种体系试剂盒中,含有DNA、RNA扩增所需的所有试剂,研究者只要准备好引物和模板就行了。扩增结果可以分别通过凝胶电泳检测、荧光定量检测或试纸条检测,产物纯化后可用于下游研究。
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