2017-10-01DNA序列的PCR引物设计

1，PCR引物是利用碱基互补原则，通过找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。2，首先要找到你用来设计引物的目的基因全序列，一般NCBI、Genebank上都能找得到。3，引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导 致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；引物3’端尽量不要出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，这样会会增加错配几率，3’端尽量不要以A为结尾； 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大； ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳 定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应；对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物 的载体的相应序列而确定。

疯了………………你这个是要实验用还是要交作业啊…………引物设计首先需要找到你要P出来的序列。让我们假设这一段就是你要P的东西………………第二步就是在该序列或者附近直接用原序列做引物。你这个为例的话，5'就是TCGATG，而3'就是TAGGCT。注意5'就是原序列而3'则是互补序列。还需要注意的是，两个primer都是5'-3'的写法。第三步则应该是在全序列中寻找这两个引物是否会出现错配，以及错配的严重情况。错配严重的在PCR之后会出现较小的杂带。还有就是引物自身会不会出现发夹（就是引物自己的局部会发生错配），两条引物会不会形成互配等等（这些都是不存在为最好的）。这两个会影响PCR产物的量，严重的会没有产物形成。因为是做PCR的，还需要检查两条引物的TM（变性解聚需要的最低温度）值是否接近（接近为好）。真正设计引物的时候经常还需要考虑加入酶切位点，这样的话，酶切位点因为是回文结构，错配就会无法避免，不用考虑了。基本上设计引物的要点就是这些了。有什么不懂的你再补充。回答补充：至少我老师给我讲引物设计的时候，没有说过开头能否使用CG之类的东西……关于引物中GC的问题，一般说其含量在40~60%左右时，P的效果最好。但是也有人用实验证明小于或大于这个范围同样可以做的很好。上次还忘记说了，引物设计中比较关键的是3'端。那里的序列是不能动的，因为P的时候就是3'端的紧密结合开始的。相对的，如果要做任何改动，可以考虑5'端，但也最好不要直接从头开始改。留下几个碱基作为保护碱基可以提高引物的效果。展开

下载一个primer premier吧有引物设计功能 可以计算自有能变化 以及各种回文 错配结构的稳定性很有用

forward primer - 5‘ GCTCGA 3'reverse primer - 5 ' GCTAGG 3'

向左转|向右转