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5.6 引物延伸法 RNA 分析一引物延伸法 RNA 分析
mayitao
/发布时间:1533259744 /浏览量:40
| 实验材料 | T4多核苷酸激酶AMV反转录酶酵母tRNA 试剂、试剂盒 | 10X激酶缓冲液5X杂交缓冲溶液Tris-HClMgCl2DTT放线菌酮DdNTPRNasin甲酰胺上样染液SephadexG-25NaAc乙醇[r-32P]ATP 仪器、耗材 | 水浴杂交炉电泳设备
实验步骤 | 一、材料与设备 1)水浴 2)杂交炉 3)电泳设备 4)T4多核苷酸激酶，AMV反转录酶 5)10X激酶缓冲液：5mol/LTris-HCl(pH7.6)，0.lmol/LMgCL2，50mmol/LDTT，lmmol/L亚精胺.1mmol/LEDTA 6)5X杂交缓冲溶液；2mmol/LNaCl,50mmol/LPTPES(pH6.4) 7)1X延伸溶液： lmol/LTris-HCl(pH8.3) 10ul 120mmol/LMgCl2 10ul 200mmol/LDTT 10ul 1mg/ml放线菌酮D 5ul lOmmol/LdNTP 10ul RNasin40U 1ul 加水至 I78ul 8)甲酰胺上样染液：80%去离子甲酰胺，45mmol/LTris-HCl(pH8.3)，45mmol/L硼酸，1.25mmol/LEDTA，0.02%二甲苯青 9)SephadexG-25,用约50倍体积的TE[10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1.0mmol/LEDTA]重悬SephadexG-25,高压灭菌15min，冷却后存于4℃ 10)酵母tRNA:浓度为25mg/ml，用DEPC水配制，注意避免RNase的污染，保存于塑料瓶中，存于一20℃ 11)3mol/LNaAc 12)70%乙醇：用DEPC水配制 13)[r-32P]ATP 二、操作方法 (一）用T4多聚核苷酸激酶放射性标记引物 1)将引物溶于水或TE缓冲液中，终浓度为0.4ug/ul，再依次加人下列组分: 引物 1〜5pmol(0.4ug) 10X激酶缓冲液 1ul [γ-32P]ATP 35uCi(3000Ci/mmolL) T4多聚核苷酸激酶 20U DEPC水补足 10ul 2)混合并于37℃温育0.5〜lh，加入250mmol/LEDTA终止反应 3)用TE将总体积加至100ul。通过SephadexG-25柱将未标记的引物从激酶化的引物中分离出来，收集第一个放射活性峰，65℃温育l0min以灭活了T4多聚核苷酸激酶 4)用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24:1)抽提，向水相中加入NaAc和MgCl2至终浓度分別为0.3mol/L和5mmol/L,并加入lOugtRNA。加入2.5倍体积的无水乙醇.放在干冰中10min，12000g4℃离心30min,用70%的乙醇离心洗涤沉淀.将沉淀干燥并重溶于80ul无菌水中 (二）杂交 1)在微量管中，混合下列组分： 靶RNA 0.1〜5fmol(最多为20ug的总RNA) SX杂交缓冲液 4ul 标记的引物 1〜50fmol 加水至 20ul 2)于70℃，温育3min 3)在54℃杂交1.5〜4h (三)延伸反应 1)样品屮加入178ul延伸缓冲液，置与冰上 2)加入lulRNasin和1ul反转录酶,42°C:保温lh 3)加入20ul和2.5倍体积的无水乙醇，在干冰中放置10min,12000g离心15min,用70%乙醇离心洗涤，空气干燥2min 4)用甲酰胺上样染液重悬沉淀，注意要充分混匀。 5）90℃热变性3min,然后置于冰上 6)将8ul样品上样于变性聚丙烯酰胺凝胶，同时加入DNA分子质量标准物后进行电泳 注意事项 | 1)延伸反应产物的总暈与退火时间的K短成正比的增加（退火时间不超过12h）若超过12h即使增加退火时间也不显著增加反应产物总量，因为产物形成中增加的部分会由于非特异性降解而失去 2)所需总RNA的M决定于靶RNA的浓度，最好通过预试验以确定出RNA的浓度范，从而得到满意的结果 3)使用短至17个核_ff酸的引物也很成功，当为引物延伸测定法设汁引物时，其靶序列务必位于RNA5＇末端的100个核苷酸的区域之内，这样可减少潜在的不均一延伸产物，它们的产生岳由于反转录酶在模板KNA的一级结构区域里终止或暂停作用造成的。单链的寡核苷酸（5＇端未磷酸化）是引物域力便的来源D此外，引物也可以从相应的克降的基因通过限制酶消化而获得。利用一对相距20〜l0bp并可产牛.不同长度的黏性未端的稀有酶切的位点，经酶切后产生不同长度的条编码链和一条非编码链。对两次切割位点之间的片段作放射性标汜可产生个独一无二的末端标汜片段，在变忡的内烯酰胺凝胶上.电泳和放射D显影后町以将其与非编砰链分开。两条链的长度相差愈大，限制酶切的片段就愈小.探针的分离也就愈好。也可用一个独一无二的末端标记的双链引物.因为RNA-DNA杂合分子比DNA-DNA杂合分子更稳定（其最适杂交温度大约尚5℃)。不过用双链引物时需精确测定杂交温度，这就降低了这一技术的效率。理想的情况是引物应标记5＇端，限制晦切片段的V端磷酸必须在激酶处理之前先用碱性磷酸酯酶除去，不过如仅仅用作对某个mRNA的定量测定，那么3＇标记也是可以的。实际应用限制酶所产生的探计可能更为简单一些（例如，对于产生不同大小的链标可能是重要的），采用均匀标记的探针可使引物延仲分析法的灵敏度得到改进。引物离帽位点愈远，则反转录酶的作用在RNA二级结构的部位上或在RMA降解（例如被RNase降解）的部位上过早终止的可能性就愈大，这些不连续的「早熟」的带他帽位点信号减弱。如将引物的位点移到对延伸存强大阻砑作用的二级结构的5＇端处，则可以改进帽位产物的得率. 4)若将标记引物与止在制备的待分析RNA先行合，引物与RNA便可以共沉淀下来，沉淀可溶于DEPC水中，杂交反应所需的其他成分便可直接加入此S新悬浮的沉淀中，引物和待分析的RNA与杂交缓冲液混合，加热至70℃破坏RNA(或引物）的二级结构，然后再进行复性 5)杂交时引物浓度约为互补的RNA摩尔浓度的10倍，如果超过太多〔特别是当杂交严格度低于最适时）会造成非特异性的启动。杂交的最适温度取决于引物的K度及其碱基组成。计算RNA-DNA杂合分子的解链温度的公式并不适用于计算短链的DNA引物。大多数探针的解链温度在指定的缓冲液中为45〜65℃。应该用这范围内的温度进行小规模的试验，对专一的引物-mRNA的结合确定最适杂交温度&杂交反应进行3〜6h。在高温中RNA对热敏感，因此最适杂交温度高的#物复性时间愈短愈好 6)检测杂交效率的一个简单办法是对RNA-以物杂合分子作一个修正的S1核苛酸定位试验。就是将寡核背酸和RNA在待确定的杂交溫度范围内杂交3〜6h，用S1核酸酶消化余合分子，然后在变性的丙烯酰胺凝胶上电泳，测定被保护的（杂交的）寡核苷酸量。产生最大的抗S1核酸酶的标记物的温度应诙用作以正式的杂交反应温度 7)应该对目标mRNA的用量优化，即通过用不同量的RNA制备物进行个典型的杂交反应，这里可以用细胞质总 RNA，不过用poly(A)+RNA 可以得到灵敏度更髙和更清晰的结果。 8)核糖核酸酶抑制剂RNasin可以用在延伸反应中（1ul，约为40U)，但在杂交反应中效果较小，因为在保温会消除二级结构以及在高温进行的复性反应，这样都能使RNasin的蛋白质变性。此外RNasin的活件严格依赖于最低量的1mmol/L二硫苏糖醇，而一硫苏糖醇在高温屮也不稳定。延伸反应在42°C进行以减少mRNA的二级结构的形成，后者可以使反转录过早终止,延伸反应件往在帽邻近处形成不止一条带，这可能代表真正的转录多起始点，此外，认为如果mRNA的帽位上的或邻接的核苷酸上发生甲基化，则可使反转录酶的作用在一部分分子中过早终止。在精确测定转洪起始点时，这些影响都应加以考虑。在不同甩的转染细胞中的几种帽位点条带之间的比例有所不同，但对一定来源的mRNA此比例则保持恒定不变 9)反转珙酶催化的CDNA冋折合成吋以形成额外的条带，刼管在延伸缓冲液中加入的放线菌素D能够降低这一活件。焦磷酸钠（80mmol/L)似乎效果更好，但它对某些来源的反转录酶忖能有抑制作用。引物与组织培养细胞的内源性RNA或与载体rRNA之间的交叉有时吋以W致出现假带。从不表达该基因的细胞中分离RNA作引物延伸反应并将其作为对照，就可以鉴定出这拽假带D
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