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2021-07-25载体构建，菌落PCR酶切鉴定都正确，测序无目的片段

xiaoyuer6688
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最近在构建质粒，遇到奇怪的问题，向大牛们求助！！通过CDNA文库扩增目的基因片段后连接至载体上，转化后挑取克隆进行菌落PCR鉴定，选择阳性菌落扩增后提取质粒，再将质粒酶切鉴定，选择酶切结果正确的质粒送测序，通用引物测序结果显示上游测序结果为载体序列，无目的基因序列，下游引物无信号？！崩溃了，为嘛！我同一批做的其他几个质粒都没有问题，这个质粒构了两次了都这样。。。欲哭无泪啊，求大神们慷慨相助！！

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相关回复

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回复：时间：2021-08-02

我用了很多年的病毒载体，各种病毒也包过非常多，欢迎大家来我的病毒包装与质粒转染精华答疑贴答疑贴子链接：腺相关病毒包装（AAV）、慢病毒包装、腺病毒包装、细胞转染、病毒在体转染【技术答疑】

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回复：时间：2021-07-26

如果你确认酶切没问题，换家测序公司测序

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回复：时间：2021-08-05

应该是小片段污染，插入进去的都是很短的序列

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回复：时间：2021-08-02

把转化后的全部质粒全都送去测序（先不验证）。因为测序结果是最有说服力的。筛选测序返回的结果，最后对序列正确的质粒做PCR及酶切验证。

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回复：时间：2021-07-29

实在不行你就用同工酶进行无缝连接吧，这样省事还省钱，成本差不多

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回复：时间：2021-07-27

重新做一遍。或者外包

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回复：时间：2021-07-28

楼主发现是什么原因了吗？我现在构载体，情况和你的一样，很苦恼，求告知原因

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