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2021-07-28百万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序显示目的基因已连在载体上，菌落PCR也可以P出目的条带，为什么双酶切只有一条带！！！！

dxy_20y4ry49
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1、目的基因与质粒载体（pET21b）双酶切连接，转DH5a感受态细胞，挑取单菌落，菌落PCR可以P出目的条带（引物是pET21b载体上设计的），扩大培养，提取质粒，但是双酶切只有一条带，测序显示目的基因已连在载体上，双酶切了很多次，都切不出来目的条带，也不是酶切体系（20-100ul都尝试过）和酶切时间（3-4h,过夜都试过）的问题。

求高手指点，到底哪里出问题了！！！

*请输入10-500个字符

相关回复

已帮助 0人

回复：时间：2021-07-29

Is the construct maxiprep sequenced? If it is, have you tried sequencing using primers the nucleotide sequence of which is derived from the insert DNA?

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回复：时间：2021-08-03

试过的，分别涉及两对引物，一对在插入的目的基因上，一对在载体上，做质粒PCR都可以P的出目的条带，但是再做双酶切，都只有一条带。

有用（0）

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回复：时间：2021-08-03

Canyoufindthetwoenzymesitesinthesequencedata?

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回复：时间：2021-08-05

是不是连接后没有酶切位点？我之前做的单酶切，连接目的基因后，又做的酶切，通过没有酶切成线性质粒，证明我的目的基因连接上了。跟你的思路完全相反。仅供参考。

有用（0）

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回复：时间：2021-08-06

会不会是其中一个酶切位点发生了突变或者甲基化导致切不下来?

有用（0）

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回复：时间：2021-08-07

重新连接后的目的序列，经测序分析，双酶切位点都还在的。谢谢各位，已找到原因。

有用（0）

已帮助 0人

回复：时间：2021-07-28

您好，我是新手，最近遇到了与你一样的问题，请问你是怎样找到问题所在的呢？？

有用（0）
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