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双脱氧法DNA测序实验一测序酶进行标记测序反应
mayitao
/发布时间:1632072607 /浏览量:181
| 实验材料 | DNA 试剂、试剂盒 | 寡核苷酸引物测序酶终止混合液测序酶缓冲液焦磷酸酶混合液 仪器、耗材 | 离心机离心管微量滴定板
实验步骤 | 1. 对于每个单链模板：将下列试剂混合于0.5ml微量离心管中 （1）0.5pmol单链DNA模板 （2）0.5pmol引物 （3）1μl10×测序酶缓冲液 （4）加水至10μl （5）用吸管上下抽吸轻轻混匀（避免产生气泡）。于65℃温育6min，然后于37℃温育20min，转到步骤3。 2. 对于每个双链DNA模板：以下列混合液重溶含0.5pmol变性双链模板的干燥沉淀物。 （1）1pmol引物 （2）1μl10×测序酶缓冲液 （3）加水至10μl （4）用吸管上下抽吸轻轻混匀（避免产生气泡），于37℃温育30min，然后在此退火温度下放置直至进行步骤3。 3. 当引物正和模板退火时，对应每个待测模板，分别标记好A、C、G、T4个微量离心管。  DNA测序用酶的特性 3. 分别加入2.5μlA、C、G、T测序酶终止混合液至A、C、G、T管的底部 4. 在临用前，才用测序酶稀释液稀释测序酶/焦磷酸酶混合物至1~2U测序酶/μl，置于冰浴。 5. 将下列试剂加入已退火的引物和模板中 （1）2μl 标记混合物 （2）0.5~1.5μl 10mCi/ml［α-32P］dATP （3）2μl 稀释的测序酶/焦磷酸酶混合液 （4）总体积在14.5~16μl，于25℃（室温）温育5min。 6. 加入3.5μl标记反应物至含测序酶终止混合物A的微量离心管中。 7. 用吸管上下抽吸轻轻混匀，对 A、C、G、T 管重复此过程，每次均需更换吸头，于37℃温育5~10min。 8. 加入4μl终止/加样染料液，于95℃水浴2min，然后置于冰浴。 9. 每样品各取2~3μl加样于测序胶进行凝胶电泳并读出序列。
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