二代测序文库构建方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及二代测序文库构建方法。该方法省去了传统建库实验中的繁琐的离心柱式纯化和片段筛选的割胶柱式纯化，操作简便，可以与自动移液系统整合后完成全自动的二代测序文库构建。同时优化了磁珠纯化的过程，使建库实验成本产生极大的下降。本发明在保证较高的文库构建质量的同时，能够极大地提高实验效率，降低实验成本。
【专利说明】二代测序文库构建方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及二代测序文库构建方法。

【背景技术】
[0002]二代测序也称深度测序、大规模平行测序，其核心思想是边合成边测序(SequencingbySynthesis),即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，目前主要有三种主流的测序平台：Illumina公司Hiseq平台，lifetechnologies公司的PGM平台以及Roche公司的454平台。高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术（nextgenerationsequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（deepsequencing)。
[0003]二代测序由于其超高的测序能力在科研和临床中具有极为重要的应用。然而，虽然二代测序大大降低了DNA分析的成本，其样本制备过程依然繁琐，成为其今后广泛应用中的一种障碍。
[0004]无论哪种二代测序平台，测序前都需要将对需测DNA片段进行一定的处理，使DNA符合测序平台的要求，这就是二代测序的文库构建。一般来说，文库构建包含以下几个步骤：片段化，运用高压气体的雾化作用、超声波的气穴作用、超声波、金属离子、酶等手段或设备将DNA打断；末端修补及加A尾，使用基因工程酶将已打断的DNA片段修饰成平末端后，在DNA的3"端加上一个A尾，以方便后续的接头连接；加接头，接头的3"端有一个突出的T，它们通过类似T-A克隆的方式连接起来；割胶纯化，留下两端连接完整的产物，去掉残缺不全的DNA片段。PCR富集，进行10-12循环的PCR，使产物富集。
[0005]目前可以选择的文库构建方法包括三个大类：一是二代测序仪器提供商提供的测序仪配套文库构建试剂盒，优点是都经过了测序公司的严格质控评估，具有很好的建库效果。但其缺点也很明显：首先是价格昂贵，一般测序公司提供的建库试剂盒都是针对测序服务商，平均每次建库价格在500-1000元人民币不等；其次由于二代测序公司试剂生产基地均在境外，试剂通关时间较长，且容易发生试剂过期问题；最后测序仪器提供商往往根据自己测序仪的情况提供文库构建方案，所售试剂盒的包装大小固定，不能根据用户的需求定制，如一般建库试剂盒小包装为10次或12次反应，大包装为96至384反应。而是自动化文库构建工作站，这些自动化工作站也具有功能模块整合，实验速度快精度高，最大限度减少人为误差等优点。但同样具有仪器和配套试剂昂贵，实验灵活性不够等缺点。对于一般建库实验通量较小的实验室或医疗机构无承受其高额的运行成本。三是利用文献中实验室分享报道的实验方法自行建库。但是由于没有经过严格的质控管理，所完成的实验效果参差不齐，实验效率不高。


【发明内容】

[0006]有鉴于此，本发明提供二代测序文库构建方法。该方法省去了传统建库实验中的繁琐的离心柱式纯化和片段筛选的割胶柱式纯化，操作简便，可以与自动移液系统整合后完成全自动的二代测序文库构建。同时优化了磁珠纯化的过程，使建库实验成本产生极大的下降。在保证较高的文库构建质量的同时，能够极大地提高实验效率，降低实验成本。
[0007]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008]本发明提供了二代测序文库的构建方法，包括如下步骤：
[0009]步骤1:获得片段化的DNA，经磁珠纯化后获得第一样本；
[0010]步骤2:取第一样本补平末端，经PEG溶液纯化获得第二样本；
[0011]步骤3:在第二样本的3"端加A尾后，经PEG溶液纯化获得第三样本；
[0012]步骤4:取3"末端具有T的接头通过T4DNA连接酶与第三样本连接，获得第四样本，经纯化、回收目的片段后，进行PCR扩增，即得；
[0013]PEG溶液为PEG的氯化钠溶液。
[0014]作为优选，步骤2中补平末端的反应体系为50μL体系。
[0015]在本发明的一些实施例中，步骤2中补平末端的反应体系具体为
[0016]所述第一样本20pLlOxEndrepairbuffer5μ!νEndrepairenzymemix2.5μ?PCR水22.5f.iU
[0017]作为优选，步骤3中加A尾的反应体系为25yL体系。在本发明的一些实施例中，步骤3中加A尾的反应体系具体为
[0018]所述第二样本21μL
[0019]NEBNextdA-tailingbuffer2.5μL
[0020]NEBNextdA-tailingenzyme1.5uL。
[0021]作为优选，步骤4中PCR扩增的循环数为4?6。
[0022]作为优选，PEG溶液的配制方法为取10gPEG8000溶于50mL2.5mol/L的氯化钠溶液中，即得。
[0023]作为优选，步骤1中磁珠为AMPureXPSPRI磁珠。
[0024]本发明提供二代测序文库构建方法。该方法省去了传统建库实验中的繁琐的离心柱式纯化和片段筛选的割胶柱式纯化，操作简便，可以与自动移液系统整合后完成全自动的二代测序文库构建。同时优化了磁珠纯化的过程，使建库实验成本产生极大的下降。在保证较高的文库构建质量的同时，能够极大地提高实验效率，降低实验成本。
[0025]由于本方法中利用的纯化试剂和模块化生物工程酶都来自于经过长时间市场使用验证的产品，所构建的文库具有很高的质量。其评判方法可以从最终文库扩增需要的PCR循环数得到验证。对于1μgDNA起始量，文库构建实验完成后的PCR循环数在6到8个循环能达到〇.5μg的目的产物，代表该文库具有较好的质量。一般测序仪器提供商提供的试剂盒都能达到这个效果，但文献中或各实验室提供的构建方法则有时候需要10到12个循环。本方法经过多次验证均能在6个循环的情况下得到0.5μg目的产物，证明本方法构建的文库质量非常高。
[0026]本方法中利用磁珠纯化代替了一般试剂盒方法中使用的离心柱纯化方法，使所有的建库步骤都能够在同一个小管中进行，不需要将样本多次转移纯化。另外，本方法利用了不同条件下磁珠对DNA吸附片段大小的区别来对DNA片段大小进行筛选，去除了传统文库构建中最耗时耗力的凝胶电泳后割胶回收步骤，将实验时间缩短了1个小时以上。最后本方法由于操作简单，可以配合96孔磁力架，做到同时进行96个样本的文库构建。6到8个小时能完成96个样本的文库构建，试验效率大大提高。
[0027]现有3种文库构建方法中，普遍出现的问题是建库试剂盒价格昂贵，且货期较长，无法满足日后大量二代测序文库构建的需求，和一些预算偏小的实验室或医疗机构的要求。根据目前市场上的情况，较为成熟的文库构建试剂盒价格约在400到500元人民币/文库，这还不包括除了试剂盒外用户需要用到的配套试剂和耗材。而本方法中所有试剂和耗材总价格不超过150元人民币，大部分的试剂可以用户自行配制。极大地降低了二代测序文库构建的成本。

【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1示实施例1提供的二代测序文库构建方法中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为DNA分子标准(天根生物公司D2000)，泳道2为二代建库后样本PCR6个循环后广物；
[0029]图2示实施例2提供的测序批量文库构建方法中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道17为DNA分子标准(天根生物公司D2000)，泳道1至16为二代建库后样本PCR6个循环后产物，白框标示的泳道为没有样本的空白对照；
[0030]图3示本发明实施例1或2提供的二代测序文库构建方法的时间线；
[0031]图4示对比例提供的二代测序文库构建方法的时间线。

【具体实施方式】
[0032]本发明公开了二代测序文库构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0033]本发明提供的二代测序文库构建方法中所用试剂均可由市场购得；其中，AMPureXPSPRI磁珠（Beckman公司）、PEG8000(Promega公司）、NEBNextEndrepairmodule(NEB公司）、NEBNextdA-tailingmodule(NEB公司）、T4DNALigase(Enzymatics公司）
[0034]下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0035]实施例1二代测序文库的构建
[0036]实验方法中主要用到以下试剂：AMPureXPSPRI磁珠（Beckman公司）、PEG8000(Promega公司）、NEBNextEndrepairmodule(NEB公司）、NEBNextdA-tailingmodule(NEB公司）、T4DNALigase(Enzymatics公司）、PCR水、100%乙醇、氯化钠；
[0037]本方法实验前需要新鲜配制两种试剂：75%乙醇（100%乙醇与PCR水按3:1比例配制)，PEG溶液（10gPEG8000溶于50mL2.5M的氯化钠溶液中）；
[0038]实验仪器和设备需要用到：BioruptorUCD-200超声破碎仪、磁力架、移液枪、PCR仪、震荡仪、琼脂糖凝胶电泳仪。
[0039]主要实验步骤：
[0040]一、利用BioruptorUCD-200打断基因组DNA:
[0041]准备1μg基因组DNA，加水稀释至50μL，Bioruptor的操作请严格按照其说明书(操作开始前需遇冷15分钟，功率调至Middle档，打30秒，停30秒，运行10-11个周期)，琼脂糖凝胶电泳检测，确保条带集中在l〇〇bp-500bp(DNA长度以bp表示)。
[0042]二、AMPureXPSPRI磁珠纯化：
[0043]1、将样本转移至1.5mL离心管中，加入样本三倍体积的磁珠液（150yL左右)，充分吹打15次，混匀，室温静置5分钟
[0044]2、打开管盖并置于磁力架3-5分钟，轻轻吸弃清液。
[0045]3、加入300μL75%乙醇，注意整个过程不要碰到磁珠。
[0046]4、静置2-3分钟，吸弃上清液。
[0047]5、重复步骤3、4,这一步要把残留的乙醇吸干净。
[0048]6、静置5分钟使乙醇尽量蒸发干净。
[0049]7、加入20μLPCR水，充分吹打混匀，待下一步使用。
[0050]三、补平末端：
[0051]利用Endrepairenzymemix将片段化的DNA文库末端补平。补平末端反应体系为：
[0052]含磁珠DNA样本20μLlOxEndrepairbuffer5liLEndrepairenzymemix2.5μ?PCR水22.5μ?,
[0053]补平末端反应条件为：20°C30分钟注意PCR仪热盖要打开。
[0054]四、补平末端后的纯化：
[0055]将反应后样本从PCR仪中取下，转移至1.5mL离心管中。
[0056]1、加入110μLPEG溶液充分吹打15次，混匀，室温静置5分钟。2、打开管盖并置于磁力架3-5分钟，轻轻吸弃清液。
[0057]3、加入300μL75%乙醇，注意整个过程不要碰到磁珠。
[0058]4、静置2-3分钟，吸弃上清液。
[0059]5、重复步骤3、4,这一步要把残留的乙醇吸干净。
[0060]6、静置5分钟使乙醇尽量蒸发干净。
[0061]7、加入21μLPCR水，充分吹打混匀，待下一步使用。
[0062]五、DNA文库末端加Α尾：
[0063]利用NEBNextdA-tailingmodule在已补平末端的DNA片段3"端加上一个腺噪呤（A)。
[0064]加A尾反应体系为：
[0065]含磁珠DNA样本21μL
[0066]NEBNextdA-tailingbuffer2.5μL
[0067]NEBNextdA-tailingenzyme1.5μL
[0068]加A尾反应条件为：37°C30分钟注意PCR仪热盖要打开。
[0069]六、加A尾后纯化：
[0070]将反应后样本从PCR仪中取下，转移至1.5mL离心管中。
[0071]1、加入55μLPEG溶液充分吹打15次，混匀，室温静置5分钟。
[0072]2、打开管盖并置于磁力架3-5分钟，轻轻吸弃清液。
[0073]3、加入300μL75%乙醇，注意整个过程不要碰到磁珠。
[0074]4、静置2-3分钟，吸弃上清液。
[0075]5、重复步骤3、4,这一步要把残留的乙醇吸干净。
[0076]6、静置5分钟使乙醇尽量蒸发干净。
[0077]7、加入15μLPCR水，充分吹打混匀，待下一步使用。
[0078]七、DNA文库加上接头：
[0079]利用T4DNALigase将接头连接到具有Α尾的随机DNA文库上。接头制作是将正反链以等量混合并稀释到25μM，加热至95°C三分钟，随后缓慢降至常温，使正反链复性成为双链的结构。
[0080]接头连接反应体系为：
[0081]含磁珠DNA样本l2μL2XRapidLigationBuffer15μ?接头(25μΜ)2,liLT4DNALigase(Rapid)(600ιι/μΕ)Ιμ?
[0082]连接反应条件为：25°C10分钟注意PCR仪热盖要打开。
[0083]八、加接头后纯化以及目的片段长度筛选：
[0084]1、加接头后纯化：
[0085]1)向加接头后的30μL反应体系里加入30μLAMPureXPSPRI磁珠，吹打混匀，室温下静置15分钟。
[0086]2)打开管盖并置于磁力架3-5分钟，轻轻吸弃清液。
[0087]3)加入300μL75%乙醇，注意整个过程不要碰到磁珠。
[0088]4)静置2-3分钟，吸弃上清液。
[0089]5)重复步骤3、4,这一步要把残留的乙醇吸干净。
[0090]6)静置5分钟使乙醇尽量蒸发干净。
[0091]7)加入100μLPCR水，充分吹打混匀。
[0092]2、目的片段长度筛选：
[0093]1)向加接头后纯化的100μL样本磁珠混合液中加入60μLPEG溶液，充分吹打混匀，室温下静置15分钟。
[0094]2)打开管盖并置于磁力架3-5分钟，将155μL清液转入新的1.5mL离心管中。可选步骤：上述取出155μL清液后余下的磁珠可再加20PCR水混合均匀，静置3-5分钟，吸取出上清，作为长片段备份。
[0095]3)向上面吸出的155μL清液中加入20μLAMPureXPSPRI磁珠，充分吹打混匀，室温下静置15分钟。
[0096]4)打开管盖并置于磁力架3-5分钟，轻轻吸弃清液。
[0097]5)加入300μL75%乙醇，注意整个过程不要碰到磁珠。
[0098]6)静置2-3分钟，吸弃上清液。
[0099]7)重复步骤3、4,这一步要把残留的乙醇吸干净。
[0100]8)静置5分钟使乙醇尽量蒸发干净。
[0101]9)加入20μLPCR水，充分吹打混匀，室温下静置5分钟。
[0102]10)打开管盖并置于磁力架3-5分钟，轻轻吸取清液转入新的1.5mL离心管中。
[0103]九、琼脂糖凝胶电泳验证：
[0104]将上面洗脱后的20μL样本、以及可选步骤中洗脱的样本各取5μL进行琼脂糖凝胶（2-3%Agr〇se)电泳，验证筛选后片段长度符合要求，目的片段长度应为250-450bp之间。
[0105]十、PCR扩增：
[0106]利用NewEnglandBiolabs公司高保真聚合酶Mastermix扩增回收后的片段。
[0107]PCR扩增反应体系为：
[0108]筛选出的DNA样本ΙΟμΙ2xPhusionHFMMbuffer15μ?Primer(lOuM)1liLPCR水4μ?
[0109]PCR扩增循环条件为：
[0110]98°C30sec〃98°ClOsec4-6Cycles60-65°C(具体看引物）20sec、72。。45sec72°C7分钟4V〇〇
[0111]i^一、琼脂糖凝胶电泳验证PCR结果：
[0112]将上述PCR产物取3μL进行琼脂糖凝胶电泳，验证筛选后PCR样本片段长度符合要求，目的片段长度为300-400bp之间。如图1所示。泳道1为DNA分子标准(天根生物公司D2000,具体信息见图1)，本次电泳上样为6mL;泳道2为建库后样本PCR6个循环后产物，PCR实验时时使用了一半的建库后样本，总体系为50μL，电泳时取3μL电泳。从电泳图中PCR产物片段与DNA分子标准的比较可以发现产物片段长度大概在300bp到400bp之间；其次对比PCR产物片段与DNA分子标准亮度可以大致推断出3mL上样量的PCR产物量在50ng到lOOng之间，换算后PCR产物的总量为约0.8μg到1.6μg之间，这个产物已经超过了〇·5μg标准，产物量通过高精度的DNA定量仪QuantiFluor(Promega公司）定量结果也在0.5μg以上。同时需要注意的是本次PCR实验只是使用了一半的建库后产物，另外一半产物留作备份，所以真正的建库后产物全部PCR后的产物量应该是本次实验量的两倍，也就是超过1μg，完全达到二代测序实验的要求。
[0113]本发明提供的方法采用磁珠纯化，每次纯化时间大大减少（时间线如图3所示)。
[0114]实施例2二代测序批量建库
[0115]根据实施例提供的方法利用96孔板同时进行39个样本的文库构建，构建时间8小时。琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。泳道17为DNA分子标准(天根生物公司D2000)，本次电泳上样为6mL;泳道1至16为二代建库后样本PCR6个循环后产物，白框标示的泳道为没有样本的空白对照；本次实验利用96孔磁力板同时进行了39个样本的文库构建，建库时间为约为8个小时；泳道内产物为建库后样本PCR六个循环后产物，PCR实验时时使用了一半的建库后样本，总体系为50mL，电泳时取3微升电泳；通过与D2000分子标记对比后，发现不同样本建库后产物大小均在300bp到400bp之间，除个别样本(第二排左数6泳道和7泳道样本）外，全都达到了0.5μg的产量。
[0116]本发明提供的方法采用磁珠纯化，每次纯化时间大大减少（时间线如图3所示);本领域技术人员公知，由于可以使用96孔磁力架，因此本试验样本数不仅限于39个，可同时完成最多96个样本的建库。总时间不会超过1天。
[0117]对比例二代测序文库的构建
[0118]1、样品打断（Fragmentation):
[0119]目前样品打断方法是Nebulizer打断法，可将样品DNA打碎至100?700bp范围的片段。
[0120]1)从nebulizerkit中取出一个nebulizer,抒开蓝色的盖子，从另外一个包装袋中取出一个乙烯树脂管，套在中心喷雾管上面，将树脂管用力上推，直至与蓝盖的内表面严丝合缝为止；
[0121]2)取样品5μg-10μg左右(用TE或超纯水补足到50μl)+700μlNebulizationbuffer(50%甘油+1XTE)充分混合，然后将液体移入nebulizer中，拧紧盖子并将nebulizer埋入冰中；
[0122]3)将nebulizer的上部接口连上氮气管，慢慢的先拧开氮气瓶的主阀门，确认瓶中有氮气后，抒开副阀门，将输出压力调至〇.3Mpa，nebulizer6min，然后首先关闭主阀门，待输出压力为〇后，关闭副阀门；
[0123]4)将nebulizer放于吊篮上，450g，离心2min;-般情况应剩下400?600μ1左右的液体，且比较黏稠，
[0124]5)用QIAquickPCRPurificationKit进行回收，用1个离心纯化柱进行DNA的纯化，溶于32μ1的EB中。
[0125]2、末端修复：
[0126]1)预先从_20°C保存的试剂盒中取出10xPolynucleotideKinasebuffer和10mMdNTPsmix，将其置于冰上融解并充分混勻10xPolynucleotideKinasebuffer。
[0127]2)在1.5ml的离心管中配制末端修复反应体系：
[0128]打断后的样品30pLWater45uLIOxPolynudeotideKinaseBuffer!0liLdNTPSolutionSet4μ?_,T4DMAPolymerase5μ?_,KlenowFragment1μ!T4PolynucleotideKinase5μ?,Totalvolume100μ?.
[0129]3)将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20°C保存。
[0130]4)在Thermocycler中20°C，30min。
[0131]5)用QIAquickPCRPurificationKit回收纯化反应体系中的DNA，用一个离心纯化柱进行纯化，溶于34μ1的EB中。
[0132]3、末端加"A"（A-Tailing):
[0133]1)预先从-20°C保存的试剂盒中取出10xbluebuffer和ImMdATP，将其置于冰上融解并使其充分混勻l〇xbluebuffer。
[0134]2)在1.5ml的离心管中配制末端加"A"反应体系：
[0135]来自Section3.3的样品32μ?^IOx.biuebuffer5μ.Ι」dATP10μΙ_,Klenow(3"-5,exo-)3μ?Totalvolume50μ?
[0136]3)将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20°C保存。
[0137]4)在Thermocycler中37°C，30min。
[0138]5)用MiniElutePCRPurificationKit回收纯化反应体系中的DNA，用一个离心纯化柱进行纯化，溶于12μ1的EB中。
[0139]【注意事项】该步纯化注意要使用MiniElutePCRPurificationKit。
[0140]4、Adapter的连接（AdapterLigation):
[0141]1)预先从_20°C保存的试剂盒中取出2xRapidligationbuffer和PEAdapterOligoMix,将其置于冰上融解并充分混勻2xRapidligationbuffer。
[0142]2)在1.5ml的离心管中配制Adapter连接反应体系：
[0143]PE文库：
[0144]来自Section3.4的样品10μ?2xRapidligationbuffer25μΕPEAdapteroligomix10μ?T4DNALigase5μ?Totalvolume50xL
[0145]3)将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20°C保存。
[0146]4)在Thermomixer中2CTC温浴15min。
[0147]5)用QIAquickPCRPurificationKit回收纯化反应体系中的DNA，用一个离心纯化柱进行纯化，溶于30μ1的EB中。
[0148]5、DNA片段大小选取（SizeSelectDNA):
[0149]1)每个样品称取2g的琼脂糖于lOOmllXTAE中（2%浓度)，加热使琼脂糖完全溶解，溶液中不含有任何固体不溶物，然后将溶好的琼脂糖溶液置于
[0150]50_60°C水浴中降温。
[0151]2)取出制胶用的胶托、胶梳和凝胶架，注意选用宽孔胶梳并注意和胶托配套。仔细清理胶托、胶梳和凝胶架后用纯水冲洗最后用无水乙醇擦拭，晾干待用。
[0152]3)装配好凝胶架，将冷却至50-60°C的琼脂糖溶液倒入凝胶架中凝固，须注意琼脂糖溶液中不应有气泡，如有气泡需用吸头将气泡赶至胶块边缘。待琼脂糖凝胶在室温凝固后将其放入4°C冰箱放置至少30min。
[0153]4)小心拔掉胶梳，连同胶托将琼脂糖凝胶从凝胶架中取出待用；若琼脂糖凝胶需要隔夜放置时需拔掉梳子，放入保鲜袋中密封保存。
[0154]5)用自来水反复仔细清洗电泳槽后用蒸馏水冲洗3遍，再用无水乙醇擦拭电泳槽，室温晾干后，在电泳槽中加入少量IXTAE缓冲液润洗后待用。
[0155]6)放入制备好的琼脂糖凝胶并将预冷的电泳缓冲液1XTAE倒入电泳槽中，贴好标签准备电泳。
[0156]7)使用100bpDNALadder为分子量标准，每块凝胶点两个分子量标准，点样孔为凝胶左起第二个孔，点样量为1μ1和最右侧孔点样量为1μ1(如图8)。
[0157]8)将来自Section3.5的样品与至少6μ1上样缓冲液充分混合后，全部加入到加样孔中，连接产物加样孔为凝胶左起第四个孔，和两边Marker各间隔一个泳道(如图8)，避免交叉污染。
[0158]9)打开电泳仪电源，调好电压和电泳时间开始电泳。电泳过程中须间或关注电泳状态是否正常，100V电压电泳120min.
[0159]10)电泳过程中需清洗染胶用医用托盘，用自来水仔细清洗2遍，然后用蒸馏水冲洗3遍；在托盘中加入200ml的1XTAE缓冲液，再加入20ulEB染料，注意在染胶的盘盖上贴上标签。
[0160]11)电泳结束后取出凝胶，放入含EB染料的TAE中染色15min。
[0161]12)将紫外仪的面板用75%酒精擦拭，在面板表面铺一层保鲜膜，用记号笔在中间划一条直线，直线需与面板的下边缘平行。
[0162]13)取一块干净PE手套，将染好的琼脂糖凝胶放在上面，戴好防护目镜和面具，关闭暗房照明灯，打开紫外仪的开关，对准相应marker对应的连接产物带上的位置，切下目的片段胶块，若第2泳道和第6泳道的marker大小位置不同时，以第2泳道marker为准，各类型插入片段的文库切胶位置如图8所示。
[0163]14)将切下的胶块放入已知重量的干净的2.0ml的离心管中，称重并计算出所切凝胶的重量，贴好标签备并做好记录。
[0164]15)-般情况，除切下所需要的片段范围外还另外切下其它片段范围作为备份。如，若建库要求是1个Insert200bp的PE文库，除切下需要的300?320bp片段范围还须切下320?340bp作为备份，另外还可以切下580?600bp和430?450bp两个片段的胶块备份，以此类推。
[0165]16)完成切胶后将剩下的胶块在凝胶成像系统中拍照并存储图片（如图8)。确定没有问题后方可将所剩凝胶丢弃至垃圾桶中。
[0166]17)用QIAquickGelExtractionKit进行胶纯化回收，回收连接产物并溶于30μ1的EB(ElutionBuffer)中。打印好标签贴在离心管管壁上，方便查找。
[0167]6、PCR反应：
[0168]1)从_20°C保存的试剂盒中取出PhusionDNAPolymerase、PCRPrimer,将其置于冰上化冻并充分混勻PhusionDNAPolymerase。
[0169]2)在0·2ml的PCR管中配制PCR反应体系：
[0170]PE文库：
[0171]来自Section16的样品ΙΟμ?PhusionDNAPolymerase25μ?PCRprimer1.01μ?PCRprimer2.01μΕUltraPureTMWater13μ?Totalvolume50μ?
[0172]3)将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20°C保存。
[0173]4)在thermocycler中运行下列程序：
[0174]98〇C30s98C10s"6530sk12cycles72〇C30s.72°C5min4°C保存
[0175]5)反应结束及时将样品取出用QIAquickPCRPurificationKit进行纯化后，最后将样品溶于30μ1ElutionBuffer。
[0176]该方法由于每个步骤之间都必须用离心柱纯化样本，使实验过程繁琐，时间长(时间线如图4所示)，特别是对于较多样本的同时建库，随着样本的增多工作量增加太多，时间更长。一般每天最多能完成12个样本的文库制备。
[0177]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.二代测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1:获得片段化的DNA，经磁珠纯化后获得第一样本；步骤2:取所述第一样本补平末端，经PEG溶液纯化获得第二样本；步骤3:在所述第二样本的3"端加A尾后，经PEG溶液纯化获得第三样本；步骤4:取3"末端具有T的接头通过T4DNA连接酶与所述第三样本连接，获得第四样本，经纯化、回收目的片段后，进行PCR扩增，即得；所述PEG溶液为PEG的氯化钠溶液。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2中所述补平末端的反应体系为50μL体系。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2中所述补平末端的反应体系具体为所述第一样本20μΙ/K)xEndrepairbuffer5μ?_.Endrepairenzymemix2.5μ?_.PCR水22.5μLa
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤3中所述加A尾的反应体系为25μL体系。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤3中所述加Α尾的反应体系具体为所述第二样本21μLNEBNextdA-tailingbuffer2.5μLNEBNextdA-tailingenzymeL5uL〇
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤4中所述PCR扩增的循环数为4?6〇
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2或步骤3中所述PEG溶液的配制方法为取l〇gPEG8000溶于50mL2.5mol/L的氯化钠溶液中，即得。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1中所述磁珠为AMPureXPSPRI磁珠。
【文档编号】C40B50/06GK104099666SQ201310129624
【公开日】2014年10月15日申请日期:2013年4月15日优先权日:2013年4月15日
【发明者】覃振东,鲍芸,陈菊如,赖勤,周之权申请人:江苏基谱生物科技发展有限公司