2016-11-17载体和目的片段连不上，怎么办？ps:Takara T4连接酶

Could you describe your cloning experiments, what insert is, what vector is, how big the insert DNA is, how the insert DNA generated, cut off from other construct, or amplified from DNA or RNA, how the ligation reaction is, what the ligation temperature is, and how long the ligation is incubated? and finally, how is the bacterial transformation done?

我们实验室一直在用美国的Clonesmarter的无缝克隆试剂盒，效果很好，很稳定，您可以试试

你回收有问题。小于20ng/ul的回收浓度，一般我都认为是测试误差范围内了，我都认为是不准确的，并且浓度那么低几乎不能用，神马方法都没用。

kangaroo0513你回收有问题。小于20ng/ul的回收浓度，一般我都认为是测试误差范围内了，我都认为是不准确的，并且浓度那么低几乎可是不能用，神马方法都没用。可是为什么我同学回收之后的浓度也是个位数，最后连上了？？？另外，我又重新做了一次，这回浓度高些，但还是没有连上。。。

展开引用mparkCouldyoudescribeyourcloningexperiments,whatinsertis,whatvectoris,howbigtheinsertDNAis,howtheinsertDNAgenerated,cutofffromotherconstruct,oramplifiedfromDNAorRNA,howtheligationreactionis,whattheligationtemperatureis,andhowlongtheligationisincubated?andfinally,howisthebacterialtransformationdone?......载体9004bp,目的片段1500多bp,按1：3的比例，1:10的也试过，4度过夜和16度过夜都试过，体系20ul和10ul都试过，转化至大肠，就是不长单菌落。阳性对照正常！

Thevectorisover9kb,itseemsalentiviralvector.Youmayneedtoperformtwo-stepcloning,firsttrytomakesubcloneof1.5kbinsertinpUC19orpBlueScript,orpGEM6orsomethinglikethat,ordoT-AcloningiftheinsertisPCRamplified.Afteryouhavepositiveclone,cutoffthe1.5kbinsertandtrytodoligationwiththe9kbvector.DotransformationusingcommercialavailableStable2orStable3competentcells.

展开引用mparkThevectorisover9kb,itseemsalentiviralvector.Youmayneedtoperformtwo-stepcloning,firsttrytomakesubcloneof1.5kbinsertinpUC19orpBlueScript,orpGEM6orsomethinglikethat,ordoT-AcloningiftheinsertisPCRamplified.Afteryouhavepositiveclone,cutoffthe1.5kbinsertandtrytodoligationwiththe9kbvector.DotransformationusingcommercialavailableStable2orStable3competentcells.......你好，我的载体是酵母表达载体ppic3.5k。。为什么中间要用TA克隆，这样会增加成功率么？？？

Ninekbvectormayhavedifferentgeneticelementsassembledformultiplefunctionandisdifferentfromsimplevectorforsubcloning.Itwouldbequitehardtododirectcloningusingthismultiple9kbvector,specificallyforthose1.5kborevenlargerPCRfragment.Twostepcloningwillletyourunalittlebiteasysubcloningfirstandhavehigherchancetomakepositiveclones.Whenyouhavepositivesubclone,itwillfacilitateyoutogofurthertohavetheinsertDNAclonedinpPIC3.5Kvector.

展开引用mparkNinekbvectormayhavedifferentgeneticelementsassembledformultiplefunctionandisdifferentfromsimplevectorforsubcloning.Itwouldbequitehardtododirectcloningusingthismultiple9kbvector,specificallyforthose1.5kborevenlargerPCRfragment.Twostepcloningwillletyourunalittlebiteasysubcloningfirstandhavehigherchancetomakepositiveclones.Whenyouhavepositivesubclone,itwillfacilitateyoutogofurthertohavetheinsertDNAclonedinpPIC3.5Kvector.......你好，，我查了一下资料，有人做构建的时候把目的片段先连接到T载体上，再切下来连接到酵母表达载体上，可是我始终没明白这么做的原理，能否在原理方面解释一下。。请指教！！thankyou!

Pleasereadmytextabovecarefully.

要描述清楚点你的实验，你是直接从基因组中或RNA中PCR扩增目的片段来连接载体么？怎么连接的，双酶切产物和载体么？

du3703980要描述清楚点你的实验，你是直接从基因组中或RNA中PCR扩增目的片段来连接载体么？怎么连接的，双酶切产物和载体么？对的。我的目的片段是从基因组里PCR出来的，胶回收双酶切后，与双酶切胶回收后的载体连接，10ul连接体系，目的片段与载体浓度比为1:3，目的片段1554，载体9004；调节过浓度，体系，温度，换过T4酶（同学已经连接成功的）可是都没连上！转化失败；阳性克隆对照成功！

对于大质粒载体，酶切后，不要跑胶，直接过柱子纯化，这样浓度就能比较高了。在采用无缝克隆，克隆效率就比较有保障了

第一：保证你的载体在连接体系中总浓度有0.5-1ng/ul第二：比值是摩尔比，即目的片段所加的质量（ng）/目的片段（1554）：载体所加质量/载体(9004)，并不是浓度比

展开引用时光-过客mparkCouldyoudescribeyourcloningexperiments,whatinsertis,whatvectoris,howbigtheinsertDNAis,howtheinsertDNAgenerated,cutofffromotherconstruct,oramplifiedfromDNAorRNA,howtheligationreactionis,whattheligationtemperatureis,andhowlongtheligationisincubated?andfinally,howisthebacterialtransformationdone?载体9004bp,目的片段1500多bp,按1：3的比例，1:10的也试过，4度过夜和16度过夜都试过，体系20ul和10ul都试过，转化至大肠，就是不长单菌落。阳性对照正常！......是一个克隆都没长？？？

可以看一下载体酶切位点序列与目地基因序列是否互补，T4连接是平末端或粘性末端连接，建议4℃连接过夜。

展开引用woaizuguo2009时光-过客mparkCouldyoudescribeyourcloningexperiments,whatinsertis,whatvectoris,howbigtheinsertDNAis,howtheinsertDNAgenerated,cutofffromotherconstruct,oramplifiedfromDNAorRNA,howtheligationreactionis,whattheligationtemperatureis,andhowlongtheligationisincubated?andfinally,howisthebacterialtransformationdone?载体9004bp,目的片段1500多bp,按1：3的比例，1:10的也试过，4度过夜和16度过夜都试过，体系20ul和10ul都试过，转化至大肠，就是不长单菌落。阳性对照正常！是一......恩，一个都没长

展开引用woaizuguo2009时光-过客mparkCouldyoudescribeyourcloningexperiments,whatinsertis,whatvectoris,howbigtheinsertDNAis,howtheinsertDNAgenerated,cutofffromotherconstruct,oramplifiedfromDNAorRNA,howtheligationreactionis,whattheligationtemperatureis,andhowlongtheligationisincubated?andfinally,howisthebacterialtransformationdone?载体9004bp,目的片段1500多bp,按1：3的比例，1:10的也试过，4度过夜和16度过夜都试过，体系20ul和10ul都试过，转化至大肠，就是不长单菌落。阳性对照正常！是一个克隆都没长？？？......做克隆保证好以下几点1.高质量的片段和载体2.好的感受态3.好的连接酶4.对于大片段克隆建议把预培养的菌都铺板，可以铺多块

tilling对于大质粒载体，酶切后，不要跑胶，直接过柱子纯化，这样浓度就能比较高了。在采用无缝克隆，克隆效率就比较有保障了请问，直接过柱子纯化是去掉切胶，加溶胶缓冲液这步么？