一材料与设备

1)T4DNA连接酶

2)T4多聚核酸激酶

3)RNA供体

4)受体

5)寡核苷酸cDNA模板

6)10X连接缓冲液：500mmol/LTris-HCl(pH7.5)，100mmol/LMgCl2，200mmol/LDTT,0.5mg/mLBSA(适用NewEngtandBiolabs连接酶）或660mmol/LTris-HCl(pH7.6)，66mmol/LMgCl2,lOOmmol/LDTT(适用于Amersham/USB连接酶）

                                   


7)[Y^₃₂P]ATP(10mCi/ml,300Ci/mmol=3.33umol/L)

8)无RNase水

9)l0mmol/LATP

10)RNasin。

11)无RNase的DNase。

12)真空离心浓缩仪。

13）5XTBE:54gTris，27.5g硼酸，20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)

14)2X变性胶上样缓冲液：10mol/L尿素，1XTBE或80%甲醛，1XTBE

15)TE；10mmol/LTris-HCl(pH8.0),lmmol/LEDTA


二、操作方法

1.磷酸化3＇RNA

1)在1.5ml管中加入5ul[γ32P]ATP(50ulCi,16pmol)，用真空离心浓缩仪干燥。

2)在此管中加入：0.5ul10X连接缓冲液，3ul20umol/L3＇RNA,1ul水，0.5ulT4多核苷酸激酶,终体积为5.0ul

3)于37℃:孵育30〜60min

4)于75°C孵育l0min或92〜95℃孵育2min,灭活多核苷酸激酶。置于冰上

2.连接反应

1)在灭活的多核苷酸激酶反应管中，加1.0ul10×连接缓冲液.3.0ul20umol/L5＇RNA,3ul20umol/LcDXA模板。

2)加热至75℃2min再室温放置5min,杂交RNA与DNA。

3)在杂交反应液中加入1.l0mmol/L冷ATP，2ulT4DNA连接酶，至终体积15ul

4)于30°C孵育2〜4h。

5)加lul无RNase的DNase,于37℃孵育15〜30min

6)加16ul2X上样缓冲液，上样电泳，可以检测到标记的5＇RNA与3＇RNA以及相成于连接产物的全长分子。