工具酶

分子生物

中文名: 工具酶
归属: 基因工程

本质: 酶
领域: 生物学

工具酶DNA限制性内切酶：

生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)

限制性内切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA内切酶之分，Ⅱ型能严格识别核酸序列，并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA内切酶。识别分四核苷酸，五核苷酸，八核苷酸和六核苷酸，其中以六核苷酸为主，其序列旋转对称。切口分黏性末端和平末端，产生3′－OH和5′－P末端。内切酶品种多，使用时应注意温度、缓冲液用量（一般1μgDNA/2-5单位酶）等反应条件。

工具酶连接酶：

它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

连接酶有T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希菌DNA连接酶等。DNA连接酶可连接平端，也连接粘端。反应需有Mg²⁺和ATP存在，pH7.5-7.6。最适温度37℃，30℃以下活性明显下降，但考虑到被连接DNa的稳定性和粘性末端的退火温度，一般平端连接用20-25℃，粘端连接用12℃左右。

聚合酶有DNA聚合酶（以DNA为模板合成DNA大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌体DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA为模板合成RNA，T7或T3噬菌体RNA聚合酶）；逆转录酶（以RNA为模板合成DNA，除RNA病毒中发现外，发现大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和TaqDNA聚合酶都有逆转录活性）。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段，有5′→3′聚合酶和3′→5′外切酶活性，无5′→3′外切酶活性。可用于缺口翻译（Nicktranslation）法标记核酸，也可用于DNA序列测定，修补DNA链等。

工具酶聚合酶：

又称DNA聚合酶。系专司生物催化合成脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的一类酶的统称。

可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶；(2)依赖RNA的DNA聚合酶；(3)依赖DNA的RNA聚合酶；(4)依赖RNA的RNA聚合酶。前两者是DNA聚合酶，它使DNA复制链按模板顺序延长。如在原核生物中仅就大肠杆菌中已被发现的就有三种(分别简称为P01Ⅰ，P01Ⅱ和P01Ⅲ等)；DNA聚合酶只能在有引物的基础上，即在DNA或RNA引物的3′-OH延伸，这DNA的合成方向记为5′→3′。换言之DNA聚合酶催化反应除底物(αNTP)外，还需要Mg2+、模板DNA和引物，迄今细胞内尚无发现可从单体起始DNA的合成。同样，上述(3)和(4)是催化RNA生物合成反应中最主要的RNA合成酶，它们以四种三磷酸核糖核苷(NTP)为底物，并需有DNA模板以及Mn²⁺及Mg²⁺的存在下，在前一个核苷酸3′-OH与下一个核苷酸的5′-P聚合形成3′，5′-磷酸二酯键，其新生链的方向也是5′→3′。RNA聚合酶也大量存在于原核和真核生物的细胞中。如大肠杆菌RNA聚合酶分子量4.8×105，由5条多肽链组成，分别命名为α，α，β，β′，和γ，全酶可用α2ββ′λ表示。真核生物RNA聚合酶分子大于5×105，由10～12个大小不等亚基组成。聚合酶除作为自然界生命活动中不可缺少的组分外，在实验室中大多用作生命科学研究的工具酶类之一。

工具酶核酸酶：

核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA和RNA，用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-CDNA合成中产生的发夹环。

末端转移酶在Mg²⁺存在下，选择3′－OH端单链DNA为引物加成核苷酸，在Co²⁺存在下，选择3′－OH端双链DNA为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端标记和核酸连接的互补多聚尾（连接器）。

工具酶修饰酶：

体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalentmodificationregulation)，这类酶称为修饰酶(prosessingenzyme)。

碱性磷酸酶去除5′－P，可防止二分子DNA片段5′端P基团自身空间障碍，影响DNA分子之间的连接，一般用碱性磷酸酶处理载体DNA除去5′端P基团，在连接酶作用下目的基因的5′端P先与载体3′端OH连接，再通过复制修复另一条链，使二条链完全连接。该方法大大提高了连接效率。

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