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一、内切酶作用体系:(自建立,试过,效果很好)
EcoRⅠTaKaRa消化DNA37℃3h
ddH2O11ul
H溶液2ul
EcoRⅠ1ul
DNA6ul
37℃孵育3h
二、亚硫酸氢盐修饰过程:(翻译稿)
1.用适合的内切酶消化大分子量的DNA(避免目的基因被切割),或者通过把DNA悬于蛋白酶k/SDS缓冲液,通过26gaugeneedle5次,37℃孵育30min(降低DNA大小,利于充分变性)
2.加2.2ul新鲜配制的3MNaOH到18ulDNA样品中,搅拌混匀,短暂离心。
3.37℃孵育15min。(有的资料介绍说可以42度20min)
4.90℃孵育2min(95度5nin也可),置于冰上,短暂离心。
5.加208ul饱和的Na2S2O5PH5.0(BDH)。(加7.6gNa2S2O5到15ml水,加464ul新鲜配制的10MNaOH)
6.加12ul10mM氢醌(55mg加水50ml氢醌),混匀并短暂离心
7.加200ul矿物油,防止水分蒸发,限制氧化。
8.55℃孵育4-16h(水浴)。
9.吸弃上层矿物油。
10.①加1mlPromega’sWizardDNAClean-upresin按照指导书进行脱盐处理。每个管与2.5ml注射器相连,(注意连接紧)用吸管吸到注射器,底加2ml的离心管;轻轻加压,不要弄破膜;②加2ml80%的异丙醇洗涤,离心10000rpm,30s,底换管;柱子换到新1.5ml尖EP管,弃注射器;③加50ul预热水(60-70℃)放2-3min;离心(柱子与离心管一起,10000rpm,30s,DNA到EP管,弃柱子;
11.加50ul水到minicolumn室温下静置5min
12.离心20s收积洗提液,弃掉minicolumn
13.加5.5ul3MNaOH然后37℃孵育15min
14.短暂离心
15.加1ul糖原(10mg/ml)
16.加33.3ul5MNH4OAcetatePH7.0
17.加330ul冷(-20℃)100%乙醇,充分混匀
18.-20℃过夜(或者-70℃30min)
19.4℃下14000rpm离心15min
20.弃上清,加70%乙醇洗涤,4℃下14000rpm离心15min。
21.重悬DNA于10ul水中,室温下静置~2h,间隔旋涡振荡
22.-20℃保存DNA
hotstar酶做PCR,或者做Q-PCR
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回复:时间:2021-08-05
说明,第10部和后面的有些重复,还有,这一步是我另外加上去的,因为,这一步是可以选用不同的方法的,^_^,我是用这种方法纯化的,也是最经典的方法了,希望大家顺利
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