一、材料与设备

1.siRNA表达载体（含U6或H1启动子）。

2.人工合成的DNA寡聚核苷酸。

3.限制性内切核酸酶。

4.T4DNA连接酶。

5.DNA凝胶回收试剂盒。

6.2X退火缓冲液（200nmol/LKAc，4mmol/LMgAc，60mmol/LHepes-KOH，pH7.4)。

7.U6或H1启动子片段。

8.TaqDNA聚合酶。

9.PCR产物回收试剂盒。

10.PCR扩增仪。

二、操作方法

1.载体表达法

(1)根据所选定基因的靶序列，设计并合成两条互补的DNA寡聚核苷酸，具体的设计要依据表达的分子是发夹式siRNA分子或正义与反义RNA单链的不同而不同。



同时在寡核苷酸的两端均应包含适当的酶切位点，以便在互补的两条链退火形成双链后能在其两侧产生合适的酶切位点的未端，便于后续的克隆。

(2)用适量的无菌双蒸水溶解人工合成的DNA寡梭苷酸。

(3)在2X退火缓冲液中加入适量的无菌水和人工合成的寡核苷酸模板，使两条DNA链的终浓度均为20mmol/L，将上述混合液置于90℃变性1min，然后再置于37℃温育1h。在反应液中加入1/3体积的NH₄Ac和两倍体积的无水乙醇，置-20℃30min，然后于4℃12000r/mm离心10min以回收核酸。

(4)取siRNA表达载体（含U6或H1启动子）经合适的酶切，再经琼脂糖凝胶电泳回收，然后与步骤(3)中回收的双链核酸在T4DNA连接酶的作用下连接，将获得的阳性重组克隆进行测序以确定插入片段的正确性。在克隆的过程中应尽量保证表达siRNA分子的模板的第一位碱基与U6或H1启动子的转录起始位点相同。

(5)取适量的阳性重组质粒在核酸转染试剂如Lipofectaminc2000的介导下转染实验用细胞，然后可以在48h后观察靶基因的瞬时抑制效果，也可以依据表达栽体中含有的稳定筛选标志(如Neomycine抗性基因），采用特定的抗生素（如G418）进行筛选，获得稳定的克隆细胞株后再观察靶基因表达抑制后的长期效应。

2.PCR方法

(1)设计U6或H1启动子启动PCR扩增的5端引物，并依据表达siRNA分子的不同（表达发夹式siRNA分子或分別表达组成siRNA分子的两条单链）设计不同的3端PCR扩增引物。当在细胞中表达发夹式siRNA分子时，其3端引物包括与U6启动子3端互补的序列（20nt）、靶位点的正义链序列、loop环序列、靶位点的反义链序列、连续的5个A(U6启动子的转录终止信导，其后的序列将不被转录）以及附加的适当的酶切位点（便于后续的克隆）；如果需要在细胞中分别表达siRNA分子的正义与反义RNA单链时，釆用的3端引物包含与U6启动子3端互补的序列和靶序列的正义或反义链（19nt），在它们的3端为连续的5个A和附加的适当的酶切位点。



(2)在细胞中分別表达siRNA分子的正义与反义链时，使5‘端引物分別与表达正义与反义单链的3端引物配对进行PCR扩增，将获得的正义与反义链分别纯化后即可以在核酸转染试剂如Lipofecta-mine2000的介导下转染靶细胞。在细胞中，RNA聚合酶Ⅲ可以分别以两条PCR产物为模板转录合成siRNA分子的两条单链，它们在细胞中再退火形成双链的分子。



(3)如果要在细胞中表达发夹式的siRNA分子，使5端引物与对应的3端引物配对进行PCR扩增。将获得的PCR产物纯化回收后即可以在核酸转染试剂的介导下转染靶细胞。虽然采用的3端引物相对比较长，而且容易形成二级结构，在PCR扩增的时候容易引起麻烦，但这种方法相对比较简单，操作步骤较少，而且可以避免多次PCR扩增过程中引入的序列突变。



(4)对于那些通过瞬时转染筛选获得的对靶基因有较好抑制效果的siRNA分子，可以通过利用在PCR引物中引入的酶切位点将表达这些siRNA分子的PCR产物克隆到含有稳定筛选标志（如Neomycine抗性基因）的载体中，并通过相应的抗生素（如G418)筛选获得稳定表达的细胞株，由此可以观察抑制靶基因表达后细胞表型变化的长期效应。