一、材料

1.溶液与缓冲液

氯仿：异戊醇（49:1，V/V）

乙醇

异丙醇

液氮

苯酚

磷酸缓冲盐溶液PBS（仅供悬浮细胞和单层细胞用）

乙酸钠（2mol/L，pH4.0）

溶液D（变性液）



去离子甲酰胺（可选）

细胞和组织

2.离心与转子

SorvallSS-34(或与之相当的转子）；SorvallH1000(或与之相当的转子）

3.专用设备

测260nm吸光率的比色杯

组织匀浆器

用DEPC水处理过、预冷的研棒和研钵

聚丙烯管

65℃水浴

二、方法

1.选取从组织或细胞中提取RNA的适宜方法

(1)组织

①分离组织并立即置于液氮中。

②将约100mg冰冻组织含液氮的研钵中，用研棒研磨。研磨过程中可加入液氮使组织保持冰冻状态。

③将组织碎末移入含3ml溶液D的管中。

④用搅拌子室温下搅拌组织15~30s。

(2)哺乳动物悬浮细胞

①室温下200~1900g离心5~10min(1000~3000r/min用SorvallRT600,H1000转子）收获细胞。

②吸出培养基将细胞重悬于1~2ml冰预冷的PBS中。

③离心收获细胞，彻底吸尽PBS,每10⁶细胞加2ml溶液D。

④用搅拌子室温下搅拌细胞15~30s。

(3)哺乳动物单层培养细胞

①吸出培养基用5~10ml冰冷的PBS洗细胞一次。

②吸出PBS加入溶液D覆盖细胞，90mm培养皿加2ml(60mm培养皿加1ml)。

③将细胞溶解物移至管中。

④用搅拌子室温下搅拌溶解细胞15~30s。

2.将混合物移至一管中，在每毫升溶液D中立即加入0.1ml2mol/L的醋酸钠(pH4.0),1ml酚，0.2ml氯仿-异戊醇。加入每种组分后，盖上管盖，倒置混匀。

3.将匀浆剧烈振荡10s。冰浴15min使核蛋白质复合体彻底裂解。

4.10000g(9000r/min用SorvallSS-34转子）4℃离心20min,将上层含RNA的水相移入一新管中。

5.加入与提取的RNA等量的异丙醇。充分混合液体，并在-20℃沉淀RNA1h或更长时间。

6.10000g(9000r/min用SorvallSS-34转子）4℃离心30min,收集沉淀的RNA。

7.轻轻倒出异丙醇加入溶液D溶解RNA颗粒，每1ml第一步所使用的溶液加0.3ml溶液D。

8.将溶液移至一微量离心管，涡旋混匀，并在-20℃用等量异丙醇沉淀RNA1h或更长时间。

9.在微量离心机上，于4℃最大速离心10min收集RNA沉淀。用75%的乙醇洗涤沉淀2次，重复离心。用一次性使用的吸头吸出残存的乙醇。将打开盖的离心管在实验台放置几分钟，以便乙醇蒸发。RNA不可完全干燥。

10.加50~100μlDEPC处理过的水。将RNA溶液贮存于-70℃。

11.估计RNA的浓度。