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纯化RNA实验一从培养的细胞中纯化总RNA
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| 实验材料 | 细胞 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | RNA提取缓冲液变性液水饱和酚 |
| 仪器、耗材 | 培养皿Falcon2063管 |
| 实验步骤 | 1.取1个细胞已长满的100ml培养皿，吸出培养液，加2mlRNA提取缓冲液，用橡胶刮棒刮下细胞。 RNA提取缓冲液： 变性液，20ml β-巯基乙醇，0.144ml 2mol/L乙酸钠，pH4，2ml 水饱和酚，22ml 可避光保存在4℃2~3个月。 变性液： 4mol/L硫氰酸胍：250g硫氰酸胍 25mmol/L柠檬酸钠：17.6ml0.75mol/L柠檬酸钠，pH7 0.5%十二烷基肌氨酸钠（Sarkoayl）：26.4ml10%十二烷基肌氨酸钠，293mlH2O 混合各组分，在65℃搅拌溶解。可以在室温保存3个月。 水饱和酚： 用在水浴中加热到65℃的灭菌水来溶解酚。从水浴取出后使冷却到4℃。加足量水以维持水相（上相）。可在4℃避光保存2~3个月。 2.细胞裂解物转移到一个Falcon2063管中，加200μl氯仿，混合均匀。 3.细胞冰浴15分钟。 4.细胞裂解物在4℃以5000g离心30分钟。 5.转移水（上）相，注意不要搅动交界面，水相放到一个干净的Falcon2063管中并加入1ml异丙醇（仅用于RNA工作的溶液）。 6.管子在 -20℃放至少1小时或过夜。 7.用固定角度的转头在4℃以8000g离心30分钟沉淀RNA，小心去掉上清。 8.加1ml70%乙醇洗白色沉淀物并在以8000g离心15分钟。洗3次，不要振摇。 9.最后一次70%乙醇洗涤后，去掉乙醇并稍稍离心管子收集残液。吸掉剩下的乙醇。 10.短时间干燥沉淀。空气干燥约30分钟或在真空干燥器中2~3分钟。 11.用50~100μlDEPC处理过的水重悬RNA，测量1:100稀释的样品的光密度（OD260）来计算浓度。 浓度（μg/ml）=（稀释度）[（40μg/ml·OD260）]（样品的OD260） 12.重悬的RNA贮存在-70℃。 |