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纯化RNA实验一从培养的细胞中纯化总RNA
实验材料 | 细胞 试剂、试剂盒 | RNA提取缓冲液变性液水饱和酚 仪器、耗材 | 培养皿Falcon2063管
实验步骤 | 1.取1个细胞已长满的100ml培养皿,吸出培养液,加2mlRNA提取缓冲液,用橡胶刮棒刮下细胞。 RNA提取缓冲液: 变性液,20ml β-巯基乙醇,0.144ml 2mol/L乙酸钠,pH4,2ml 水饱和酚,22ml 可避光保存在4℃2~3个月。 变性液: 4mol/L硫氰酸胍:250g硫氰酸胍 25mmol/L柠檬酸钠:17.6ml0.75mol/L柠檬酸钠,pH7 0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarkoayl):26.4ml10%十二烷基肌氨酸钠,293mlH2O 混合各组分,在65℃搅拌溶解。可以在室温保存3个月。 水饱和酚: 用在水浴中加热到65℃的灭菌水来溶解酚。从水浴取出后使冷却到4℃。加足量水以维持水相(上相)。可在4℃避光保存2~3个月。 2.细胞裂解物转移到一个Falcon2063管中,加200μl氯仿,混合均匀。 3.细胞冰浴15分钟。 4.细胞裂解物在4℃以5000g离心30分钟。 5.转移水(上)相,注意不要搅动交界面,水相放到一个干净的Falcon2063管中并加入1ml异丙醇(仅用于RNA工作的溶液)。 6.管子在 -20℃放至少1小时或过夜。 7.用固定角度的转头在4℃以8000g离心30分钟沉淀RNA,小心去掉上清。 8.加1ml70%乙醇洗白色沉淀物并在以8000g离心15分钟。洗3次,不要振摇。 9.最后一次70%乙醇洗涤后,去掉乙醇并稍稍离心管子收集残液。吸掉剩下的乙醇。 10.短时间干燥沉淀。空气干燥约30分钟或在真空干燥器中2~3分钟。 11.用50~100μlDEPC处理过的水重悬RNA,测量1:100稀释的样品的光密度(OD260)来计算浓度。 浓度(μg/ml)=(稀释度)[(40μg/ml·OD260)](样品的OD260) 12.重悬的RNA贮存在-70℃。
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