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实验方法原理	非程序DNA合成（UnscheduledDNASynthesis：UDS）即S期外的DNA合成。 在一般情况下细胞内DNA合成只见于S期，但当处于非S期细胞DNA受损伤时，随着DNA损伤的修复也将发生DNA合成现象，即UDS。 在化学致突变物、致癌物作用诱发细胞DNA损伤时，也诱导DNA出现UDS现象。 因此，UDS是检测环境致突变物、致癌物的短期测试方法之一。 如被检物具有致突或致癌性，当把同位素标记的DNA前体物加入培养环境中，受损DNA仍能在DNA合成期外，以半保留复制的方式把DNA前体掺入到DNA链中，遂可应用同位素技术检测出来。
实验材料	细胞
试剂、试剂盒	EMEM羟基脲胰蛋白酶MNNG
实验步骤	以人二倍体成纤维细胞W138为例 一、实验组合   为证实被检物作用的确切性，应做如下实验组合安排 二、放射自显影法UDS的测定   1. 细胞培养 WI-38成纤维细胞，完全培养液支持物盖片培养法培养，细胞生长至汇合时； 2. 抑制DNA合成 弃旧培养液，加入不含精氨酸的EMEM培养液，继续培养20～24 小时； 3. 加测试物 加入10mM羟基脲（阳性对照加MNNG），培养2小时； 4. H-TdR处理 2、3、4每皿内加3H-TdR（5μC/每皿）后，培养20～24小时； 5. 漂洗 去除培养液，用不含钙、镁BSS漂洗； 6. 制片 制备放射自显影标本方法（参考原位杂交基因定位法）固定细胞、涂胶、曝光、显影及染色； 7. 观察 在油镜下计数，首先要排除S期半保留复制细胞（为银粒密集覆盖的细胞核），只计数核上的银粒数目，再扣除本底（每例计数30～50个细胞），结果以银粒数/核的均值或含10个银粒左右细胞的百分率表示。 三、液闪计数法 1. 细胞培养和处理 人二倍体成纤维细胞：接种在培养皿中培养； 2. 加培养液、MNNG、羟基脲，以及3H-TdR处理等与前5项相同，自5漂洗后； 3. 消化 用0.25%胰蛋白酶消化、制成悬液； 4. 液闪计数标本制备 10%三氯醋酸处理，将细胞收集在玻璃纤维滤纸片上，无水乙醇脱水烤干、置液闪杯中、加闪烁液、置液闪计数仪上计数；结果以dpm/106细胞或cpm/每皿细胞表示。 展开
注意事项	一、影响UDS的因素 1. 本底 与S期DNA合成不同，UDS的量很低，必须将本底控制在相当水平，才能显示UDS。控制本底的关键是减少S期DNA合成；用缺精氨酸的Eagle液培养及羟基脲处理可达到此目的。 做上述处理后也仍有一定量的本底，其来源包括 （1）少数S期细胞的半保留复制； （2）轻度的微生物污染； （3）胞浆线粒体的DNA合成； （4）自然修复； （5）3H-TdR非特异性附着；   （6）放射化学杂质； （7）胸腺嘧啶催化物的重新利用。   为控制本底，除减少或消除上述因素的影响外，值得注意的是，羟基脲用量过大时也会抑制UDS，并有干扰待检物的作用。因此，应根据不同细胞选择羟基脲的浓度和作用时间，至少使已知阳性致癌物作用能在羟基脲抑制本底水严时显示出来。 2. 药物特性 不同致突变物对细胞作用方式不同，诱导DNA损伤的类型也不用。因此，不同药物的用量及作用时间也不一样。 例如，氮芥在10-4M时，作用淋巴细胞2小时就能诱发明显的修复合成，而MNNG引起UDS的高峰却是在作用后的12小时。 检测不同药物，尤其环境致癌物时，应先作剂量反应曲线，选出最佳显示UDS时间，还要考虑代谢活化作用，避免出现假阴性结果。 3. 细胞 当检测实验细胞的DNA修复能力。用紫外线照射50个细胞，结果以银粒数/核的均值或含10个银粒左右细胞的百分率表示。用二倍体细胞进行实验时，应先做核型分析。 展开
其他	一、UDS实验需用适宜细胞，能表达UDS指示的理想细胞应该具有 1. 修复DNA损伤能力； 2. 能代谢活化致癌物； 3. 间期细胞比例大，以及取材方便等性质。 但是，并非每种细胞都具备上述要求条件。 实际上随细胞的不同各有利弊。常用以下几类细胞 1. 原代培养大鼠肝细胞 具有代谢活化致癌物及修复DNA损伤能力，但S期细胞比例大，适合用放射自显影法显示UDS，不宜作液闪计数。 2. 人外周血淋巴细胞 处于静止期细胞多为显示UDS的有利条件，但做致癌物筛选时，存在个体之间的差异问题。 3. 人二倍体成纤维细胞 可用WI-38（ATCCCCLN075），能快速大量增殖，在细胞汇合成单层后，发生接触抑制、细胞停止生长、DNA合成停止；用放射自显影或液闪计数都能获满意的UDS效果，是比较理想的细胞，不足的是不能代谢活化致癌物。 二、结果评价   UDS反映致癌物对细胞的损伤和DNA修复，可用于检测和筛选环境致癌物，有人检测化学物的致癌性，结果证明灵敏度为68%，附合性为69.1%。因此UDS是快速、敏感筛选环境诱变和致癌物方法之一。UDS水平即DNA修复性计算是以每次实验105细胞中实验组和各对照组掺入3H-TdRdpm之比。 展开