2021-07-26【交流】单抗讨论小组话题七:抗原的设计与合成——小分子药物单克隆抗体制备的关键[精华]

呵呵，楼主是这方面的专家，转载相关资料，供大家交流为产生有效的抗体，第一步是设计好的抗原，此抗原可以来源于整个蛋白质的一部分：一个或几抗原决定簇区域的序列。 （1） 什么是抗原决定簇？ 蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构） 组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。 （2） 选择抗原决定簇 为选择好的抗原决定簇，应符合以下三点： 1．亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的； 2．处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合； 3．有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。 （3） 抗原性与免疫原性 单独的抗原决定簇是不能产生免疫反应，它只有抗原性但没有免疫原性，为使它能具有免疫原性，它必须偶联在载体蛋白上。 （4） 抗原决定簇的预测 对每个氨基酸的表面可接触性(Surface Accessibility)、亲水性(Hydrophilicity)和弹性(flexibility)进行计算可以大体推算出抗原决定簇区域，抗原决定簇区域应综合以上三个特点。目前市面上有几个专业测定软件满足需要：如MacVestor , Protean , GCG 等。 （5） 设计合成多肽 一旦抗原序列决定后，接下来就是设计所需合成的多肽了，设计时除了注意其序列外，同时应考虑一些产生免疫机制问题，如： 1．载体蛋白的接入位置； 2．如果其序列是位于蛋白C 端的，此多肽C 端一定是自由的羧基团，而N 端被掩盖。同时如果载体蛋白是通过半胱氨酸偶联，此半胱氨酸应处于N 端位置，使C 端完全暴露给免疫系统。 3．相反，如果其序列是位于蛋白质N 端，此多肽C 端应掩盖，暴露出N端，而载体蛋白应在C 端。 （6） T 细胞抗原决定簇 不是所有多肽序列是用来直接产生抗体的，特别是一些序列短、并通过多抗原肽系统获得的免疫原性的肽。而这些是通过T 辅助细胞抗原决定簇来产生免疫。一个T 辅助细胞抗原决定簇多肽序列可以增强B 细胞产生抗体能力，但是又是由其遗传背景所决定的，设计此类多肽必须知道其抗原决定簇和被免疫动物的遗传背景。

合成的人工抗原免疫原性受到多种因素的影响，设计时需要考虑主要因素包括载体蛋白的性质、半抗原的分子空间结构、间隔臂的长度和分子结合比。常用的载体蛋白有牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白（RSA）及人工合成的多聚赖氨酸（PLL）等，较多选用BSA作载体蛋白，原因是BSA理化性质稳定，不易变性，价廉易得，分子内含自由氨基多，在较大pH值范围和不同离子强度下均能保持较大的溶解度，更有利于偶联反应的进行。Thomas报道，人工抗原的免疫原性与半抗原分子空间结构的复杂程度呈正相关，含有芳香结构的半抗原偶联成功率为33%，不含芳香结构的半抗原偶联成功率仅有9%.Sionf等认为，一定长度的间隔臂的介入，有助于半抗原结构的暴露，有利于特异性抗体的产生，间隔臂过长可形成新的抗原表位，易被细胞识别而产生“桥抗体”，间隔臂过短则载体蛋白的空间位阻将影响细胞对半抗原的识别，不产生特异性抗体，最好的间隔臂是3～6个直链碳，长度以5～8Å为宜，以－N＝N－作间隔臂，长度适宜，既可产生特异性抗体，又避免了桥抗体的出现。关于半抗原与载体蛋白的最佳分子结合比目前尚未形成定论，Eilange]提出最佳分子结合比为5～25∶1，Schneider等提出以10～20∶1为好，吴松如等认为以3～45∶1为好。个人认为，不同半抗原其分子构象、电子分布、结构复杂性、基团极性、亲水性或疏水性等性质不同，最佳分子结合比也不尽相同。不同的结合比的合成抗原，可以通过调节不同的免疫剂量得到较佳的免疫效果。

请教：其中“ε结合物”你怎么得来，是否冻干，定量溶解，然后求ε？ε=A/C(A:吸光度;C:摩尔浓度)结合物就是合成的完全抗原,通常在合成好之后就用考马斯亮蓝测其浓度,然后经紫外扫描得到吸光度,二者比值即为ε.冻干后再定量溶解也可以,但一般合成好之后抗原都为溶液,考马斯亮蓝测蛋白浓度更为简便一些.

呵呵，楼主是这方面的专家，转载相关资料，供大家交流为产生有效的抗体，第一步是设计好的抗原，此抗原可以来源于整个蛋白质的一部分：一个或几抗原决定簇区域的序列。（1）什么是抗原决定簇？蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。（2）选择抗原决定簇为选择好的抗原决定簇，应符合以下三点：1．亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的；2．处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合；3．有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的N端及C端是很好的抗原决定簇区域。（3）抗原性与免疫原性单独的抗原决定簇是不能产生免疫反应，它只有抗原性但没有免疫原性，为使它能具有免疫原性，它必须偶联在载体蛋白上。（4）抗原决定簇的预测对每个氨基酸的表面可接触性(SurfaceAccessibility)、亲水性(Hydrophilicity)和弹性(flexibility)进行计算可以大体推算出抗原决定簇区域，抗原决定簇区域应综合以上三个特点。目前市面上有几个专业测定软件满足需要：如MacVestor,Protean,GCG等。（5）设计合成多肽一旦抗原序列决定后，接下来就是设计所需合成的多肽了，设计时除了注意其序列外，同时应考虑一些产生免疫机制问题，如：1．载体蛋白的接入位置；2．如果其序列是位于蛋白C端的，此多肽C端一定是自由的羧基团，而N端被掩盖。同时如果载体蛋白是通过半胱氨酸偶联，此半胱氨酸应处于N端位置，使C端完全暴露给免疫系统。3．相反，如果其序列是位于蛋白质N端，此多肽C端应掩盖，暴露出N端，而载体蛋白应在C端。（6）T细胞抗原决定簇不是所有多肽序列是用来直接产生抗体的，特别是一些序列短、并通过多抗原肽系统获得的免疫原性的肽。而这些是通过T辅助细胞抗原决定簇来产生免疫。一个T辅助细胞抗原决定簇多肽序列可以增强B细胞产生抗体能力，但是又是由其遗传背景所决定的，设计此类多肽必须知道其抗原决定簇和被免疫动物的遗传背景。

合成的人工抗原免疫原性受到多种因素的影响，设计时需要考虑主要因素包括载体蛋白的性质、半抗原的分子空间结构、间隔臂的长度和分子结合比。常用的载体蛋白有牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白（RSA）及人工合成的多聚赖氨酸（PLL）等，较多选用BSA作载体蛋白，原因是BSA理化性质稳定，不易变性，价廉易得，分子内含自由氨基多，在较大pH值范围和不同离子强度下均能保持较大的溶解度，更有利于偶联反应的进行。Thomas报道，人工抗原的免疫原性与半抗原分子空间结构的复杂程度呈正相关，含有芳香结构的半抗原偶联成功率为33%，不含芳香结构的半抗原偶联成功率仅有9%.Sionf等认为，一定长度的间隔臂的介入，有助于半抗原结构的暴露，有利于特异性抗体的产生，间隔臂过长可形成新的抗原表位，易被细胞识别而产生“桥抗体”，间隔臂过短则载体蛋白的空间位阻将影响细胞对半抗原的识别，不产生特异性抗体，最好的间隔臂是3～6个直链碳，长度以5～8Å为宜，以－N＝N－作间隔臂，长度适宜，既可产生特异性抗体，又避免了桥抗体的出现。关于半抗原与载体蛋白的最佳分子结合比目前尚未形成定论，Eilange]提出最佳分子结合比为5～25∶1，Schneider等提出以10～20∶1为好，吴松如等认为以3～45∶1为好。个人认为，不同半抗原其分子构象、电子分布、结构复杂性、基团极性、亲水性或疏水性等性质不同，最佳分子结合比也不尽相同。不同的结合比的合成抗原，可以通过调节不同的免疫剂量得到较佳的免疫效果。

象棋筛子Thomas]报道，人工抗原的免疫原性与半抗原分子空间结构的复杂程度呈正相关，含有芳香结构的半抗原偶联成功率为33%，不含芳香结构的半抗原偶联成功率仅有9%.是的，其实现在有很多小分子药物，特别是结构简单、分子量小的，在合成完全抗原时采用衍生化法，就是将药物改造，引入新的基团，例如引入苯环，从而有利于将抗原决定簇暴露出来。展开引用象棋筛子wrote:关于半抗原与载体蛋白的最佳分子结合比目前尚未形成定论，Eilange]提出最佳分子结合比为5～25∶1，Schneider等提出以10～20∶1为好，吴松如等认为以3～45∶1为好。个人认为，不同半抗原其分子构象、电子分布、结构复杂性、基团极性、亲水性或疏水性等性质不同，最佳分子结合比也不尽相同。不同的结合比的合成抗原，可以通过调节不同的免疫剂量得到较佳的免疫效果。......同意筛子大哥的观点！:-D(y)

具体可见《蛋白质连接技术》里面关于全抗原合成的情况写的很详细，有兴趣的可以去找这本书来看看。

支持一下，贡献《蛋白质连接技术》Word和PDF版各一本，但是文件比较大，2M多，不好上传，大家有需要可以联系我。《蛋白质连接技术》已上传至免疫版网盘，请点击下载。

baitao1979：我想要《蛋白质连接技术》。请问如何联系请勿留个人信息，请勿在此跟帖，需要了去本版资源里下载

baitao1979,您好,老师,请问我可以麻烦给我也传一份《蛋白质连接技术》学习。谢谢....请勿留个人信息，请勿在此跟帖，需要了去本版资源里下载

baitao1979,您好,老师,请问我可以麻烦给我也传一份《蛋白质连接技术》学习。谢谢....

请问楼主联系方式有问题请教请勿留个人信息

《蛋白质连接技术》已上传至免疫版网盘，请点击下载。感谢baitao1979战友的友情上传！

这本书好像打不开啊，而打开的好像不是连在一起的，是断开的。

学习中

一般来说结合比还是高点好，不过做单抗，影响不大，4-70的结合比，都能筛到抗体。关键还是要试下才知道。有些说筛不到的，大部分时候是没连接上，或者结合比很低(小于1)。计算结合比最好的方法就是紫外法，如楼主所说。选择波长时最好选择300nm以上的波长，蛋白在这些波长下吸收很小，特别是半抗原有发色基团的时候，结果准确性比较高。一般不能选择250nm一下的波长，很多物质有干扰。其他计算结合比的方法，纯粹是扯淡，有些方法从原理上都很难解释得通。（红外没用过，不好评论）间隔臂其实一般也可以不用考虑，不过有的臂可能内折，戊二醛法一般不用。连接的基团一般考虑顺序，羧基、芳氨、羟基、活拨芳氢、氨基。太复杂的半抗原可能要设计合成半抗原，这个是有机合成的内容，最好请教下专业人士。半抗原偶联还有一个重要的内容是充分保证半抗原原来的结构，也就是原来的表位，有些半抗原很容易氧化。大部分情况下，所得到的抗体针对的表位，是离偶联物蛋白的最远端的刚性结构的外侧。

我用混合酸酐法标记E2-6位的衍生物到HRP或者标记到明胶蛋白上，但是发现标记的37度的稳定性特别不好。-20度放置也会降，经过重新透析，稀释后发现又可以用。不知道是什么愿因？？？？？？国外一些该产品的试剂稳定性就好得多！！！！现在急得很！！！！！敬请各位帮忙！！！！！提前谢了！！！！

我来啦，最近有些事，所以很久没来DXY了没做过这方面的，学习中......

计算结合比的方法还有SDS－PAGE和MODIA-TOF，而且后者更方便简单哦，需要的样品很少！

uangei计算结合比的方法还有SDS－PAGE和MODIA-TOF，而且后者更方便简单哦，需要的样品很少！uangei兄能否将具体的原理及方法详细说明一下,以便各位战友学习,呵呵

我也是听别人说的，具体的我也不清楚！第一种方法：就是普通的SDS－PAGE方法跑蛋白，然后用紫外凝胶成像系统分析软件得出合成抗原的分子量，进而推出分子比第二种方法：就是用MODIA-TOF检测分子量，应该只要知道这种仪器的原理就可以做了吧！

我会在近段时间内将相关的文献传上来的！呵呵！稍等啊！

呵呵。感谢

半乳糖基牛血清白蛋白的制备和测定:这篇文献介绍了将糖连接在蛋白上的还原胺法，还有MADLI-TOF法测分子比，但是没有给出具体步骤！半乳糖基牛血清白蛋白的制备和测定.pdf(140.27k)

这篇文献是关于SDS-PAGE的抗链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定.pdf(207.57k)

还有一篇老是发送错误，晚上再传好了，实验室的网速太慢了！

那篇文章我实在实无能为力了，老是说我的文章不存在，我告诉你们题目，自己去找吧，在中国知网里找！《反相高效液相色谱/基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分离鉴定螺蛳血管紧张素转换酶抑制肽》

各位战友。。好久没有来了。。我最近正在准备对环境小分子有机污染物的免疫检测技术方面的研究内容进行整理，准备形成书稿。其中的小分子主要以苯环类、杂环类有机物；农药等为主，此外还有一些生物毒素、内分泌干扰物、持久性有机污染物等等。兽药和人用药物残留等等暂不考虑，但可能有许多相通的地方。相信整理完后，能回答版上许多战友的问题，因为小分子半抗原的修饰、重新设计、合成、鉴定；完全抗原的合成、纯化、鉴定；免疫和筛选方案等确实有许多的东西值得我们思考。同时，我们课题组也在尝试建立上述物质的抗体库，期待用于大规模环境样品的快速筛查和环境污染事件的应急监测任务。工作量很大。真的想聘请具有单抗制备经历的人来我们这里工作，但是不知道往哪里发帖子好。如果对我的研究内容感兴趣，敬请给我写信吧。。邮箱：shengjw@tsinghua.edu.cn

关于偶联物(完全抗原)偶联比的测定——MALDI-TOF/MS方法其实文献中最多的关于偶联比的测定方法是紫外分光光度法，但我觉得该方法只能用于参考，很多情况下该方法测定的结果并不真实，主要是由于偶联剂的影响，因为我们认为，采用紫外测定的前提条件是：完全抗原中不含有偶联剂(如EDC)或者忽略偶联剂的存在(如戊二醛)，因此，这是不太科学的。其他方法：(1)采用电泳技术可以定性的测定，因为其分辨率不高，无法准确测定。(2)当半抗原中含有特征原子，如P原子时，可以采用测定完全抗原中P元素的方法较为精确的测定偶联比。(3)采用液相基质辅助激光解吸电离-飞行时间有机质谱(MALDI-TOF/MS)进行分析。这可能是今后的一个趋势，事实上，部分文献上的偶联比测定已经采用了该方法。关于该方法的原理，我们可以自己去找；具体操作方法和操作条件，主要由负责仪器的操作人员进行，我们也无须了解很多。我们只需给出大约50ul的样品量，容剂尽量选择水相，且离子浓度不要太大，尤其是磷酸盐浓度。就能得到一张很清晰的质谱图，图上有完全抗原的质谱峰，并标记有平均分子量，简单方便、适合分析。一般我们每次要做两个样品，一个是没有任何偶联的原蛋白样品，一个是偶联后的完全抗原样品。另外，如果完全抗原上，蛋白分子还可能残留有偶联剂的话，则应该再设计一个样品，将残留偶联剂的影响去除掉，具体的话可设计对比试验。例如下图就是我做的某半抗原与BSA偶联物的质谱图，完全抗原平均分子量为81090Da(双电荷峰为40551)，将完全抗原的平均分子量减去BSA的平均分子量(还应考虑偶联剂)，再除以半抗原的分子量，就得到偶联比。

非常感谢baitao1979uangeikivson等战友和大家一起分享珍贵文献资料!!MALDI-TOF/MS方法的确很好,我们平时用紫外法算偶联比例时在确定一个固定的波长很难有一个标准.如果使用MALDI-TOF/MS方法,需要什么仪器?如果去测试中心测的话,一般的成本如何?

就只要有这个仪器就好了，我们学校的实验中心好像就有这个仪器！但是不知道外人来测怎么收费！

hao

求《蛋白质连接技术》？谢谢！szs06@yahoo.com.cn

这个东西很多人都需要的，谢谢！

那本书不能下载了好像，我在生物秀里面下到了

展开引用kivson关于偶联物(完全抗原)偶联比的测定——MALDI-TOF/MS方法其实文献中最多的关于偶联比的测定方法是紫外分光光度法，但我觉得该方法只能用于参考，很多情况下该方法测定的结果并不真实，主要是由于偶联剂的影响，因为我们认为，采用紫外测定的前提条件是：完全抗原中不含有偶联剂(如EDC)或者忽略偶联剂的存在(如戊二醛)，因此，这是不太科学的。其他方法：(1)采用电泳技术可以定性的测定，因为其分辨率不高，无法准确测定。(2)当半抗原中含有特征原子，如P原子时，可以采用测定完全抗原中P元素的方法较为精确的测定偶联比。(3)采用液相基质辅助激光解吸电离-飞行时间有机质谱(MALDI-TOF/MS)进行分析。这可能是今后的一个趋势，事实上，部分文献上的偶联比测定已经采用了该方法。关于该方法的原理，我们可以自己去找；具体操作方法和操作条件，主要由负责仪器的操作人员进行，我们也无须了解很多。我们只需给出大约50ul的样品量，容剂尽量选择水相，且离子浓度不要太大，尤其是磷酸盐浓度。就能得到一张很清晰的质谱图，图上有完全抗原的质谱峰，并标记有平均分子量，简单方便、适合分析。一般我们每次要做两个样品，一个是没有任何偶联的原蛋白样品，一个是偶联后的完全抗原样品。另外，如果完全抗原上，蛋白分子还可能残留有偶联剂的话，则应该再设计一个样品，将残留偶联剂的影响去除掉，具体的话可设计对比试验。例如下图就是我做的某半抗原与BSA偶联物的质谱图，完全抗原平均分子量为81090Da(双电荷峰为40551)，将完全抗原的平均分子量减去BSA的平均分子量(还应考虑偶联剂)，再除以半抗原的分子量，就得到偶联比。......有条件，质谱仪的方法很好，不过这个图应该是2个蛋白交联了40551*2-水分子量=81084，太准了