1.石蜡切片脱蜡至水，冰冻切片或细胞涂片经丙酮固定10min，PBS洗3min×3次。

2.滴加0.3%H₂O₂甲醇液，室温处理20min，PBS洗3min×3次（抑内源性过氧化物酶活性）。

3.0.1%胰蛋白酶37°C消化20min或AR（只限于石蜡片），PBS洗3min×3次。

4.滴加1:（5～20）正常羊血清或牛血清20min（室温或37℃），吸去多余血清，不洗。

5.适当稀释的特异性一抗（例如来自种属A）37℃孵育60min或4℃过夜，PBS洗3×3min。

6.第二抗体（也称桥抗体，抗种属A的IgG抗体）37℃孵育40min，PBS洗3×3min。

7.抗酶抗体（来自种属A）37℃孵育40min，PBS洗3×3min。

8.酶（HRP70～100μg/ml，PBS溶解）37℃孵育40min，PBS洗3×3min。

9.0.04%DAB+0.03%H2O₂显色8～12min，最好在光镜下控制。

10.充分水洗，苏木精复染，盐酸乙醇分化15～30s。

11.常规树胶封片，结果观察。