1.将凝胶（见方案9)放入有水的平皿中。在往复式或定轨式摇床上摇5min，同时制备新鲜的固定液1。

多块凝胶的固定和染色应在分离的平皿中进行。

2.将水从平皿中排尽，在培养皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。勿用戴手套的手和凝胶直接接触。在平皿中倒人足够的固定液1以覆盖凝胶，在摇床上摇动30~60min。

3.制备新鲜的固定液2,将固定液1从平皿中排尽，用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。将足够的固定液2倒入平皿中覆盖凝胶。如果要在一天内完成银染，放在摇床上摇2h，否则，在平皿上盖一张塑料纸，在摇床上摇过夜。

如果凝胶摇动过夜，要确保在每个平皿中有足够溶液，避免凝胶干燥。

4.将固定液2从平皿中排尽。在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。

加足够的水来覆盖凝胶，在摇床上摇动5min。

5.每一标准尺寸的凝胶（160mmX20mmXl.5mm)需制备250ml戊二醒敏化溶液，现用现配，保证最小必需体积，迸行以下步骤（1）或（2）。

（1）保证凝胶正面朝上置于平皿中，将水从平皿中排尽，小心倾倒250ml戊二醛溶液，在摇床上摇动凝胶30min，速度要足以使平皿中的凝胶活动自如，但不要使其从溶液中滑出。

在染色过程中知道凝胶的方位将有助于「阅读分析凝胶」。一般来说，凝胶左边是酸性末端，右边是碱性末端。虽然这不能增强凝胶的染色效果，但有助于确定在反应中的凝胶上蛋白质的位置。

（2）加200ml戊二醛溶液至干净的干燥平皿中，仔细将凝胶从水中转移到戊二醛溶液中。转移凝胶时要小心，因其很易碎，应从它的一个角开始以避免在凝胶上的外来压力。在摇床上摇动30min。使速度足以移动平皿中的凝胶，但不要使其从溶液中滑出。

6.将戊二醛溶液排入适合的废物缸中。用水洗凝胶，将水排入盛有戊二醛的废物缸中。

7.用H2O将凝胶覆盖，在摇床上摇5min。,

8.将水排尽，重复水洗2次。

如果需要，洗涤次数可超过3次，但不能少于2次。

9.重复步骤⑦和⑧，将每次洗涤时间延长30min。

如果是5min的洗涤，按实验要求，可将洗涤次数升高，超过3次，但不要少于2次。

10.在步骤11之前30?60min制备银染溶液。

1L银染溶液足够染4块标准尺寸凝胶。

11.从平皿中将水倒出，在平皿中用一张方形塑料纸或聚碳酸酷薄片支持凝胶，将250ml银染液倒入每个平皿中。在摇床上摇动20min。如果必要，摇动时间可缩短15min，但应至少15min，或不超过20min。

12.将银染溶液倒人合适的废物缸中，确保不用戴手套的手接触凝胶。

13.用足够的水快速清洗凝胶并覆盖凝胶。将水倒人盛有硝酸银的废物缸中。

14.加足够的水来覆盖凝胶，在摇床上摇动几分钟。

15.排尽水，重复水洗这一步2次以上。

16.凝胶在洗涤过程中时，制备显色和终止溶液，将终止溶液倒入干净的干燥的平皿中。将平皿放在易于操作的位置以避免显色和终止之间的任何延迟。H?将水从平皿中倒掉，在平皿中用一张方形塑料纸或聚碳酸酯薄片来支持凝胶。

在平皿中加250ml显色液，在放有白纸的摇床上摇动凝胶。

白纸可增强染色的蛋白质点和背景的对比度，且有助于控制终止反应的时间点。

实验提示：一次不要多于3块胶。在准备显色之前在水中保存其他凝胶。合适的显色时间随每块胶的不同而不同。单独观察凝胶以决定终止反应的时间，典型的时间是当蛋白质变黑和小蛋白质点可见时。第一个蛋白质约在Imin后出现。小心不要过度显色，显色时间通常约为5~lOmin。

17.当凝胶出现有效显色时，小心抬起凝胶底边快速转移到终止溶液平皿中，轻摇1Omin。

18.弃去终止液，用H2O将凝胶覆盖，将凝胶放在摇床上直至其被扫描。

凝胶应尽快被扫描。来自终止液的胶中残余酸会引起蛋白质点随时间变弱。为得到准确结果，应在胶转移到水中30min内扫描。