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微生物拟核体内体外染色观察实验一溴化乙锭染色法
蚂蚁淘
/发布时间:1631381404 /浏览量:110
| 实验方法原理 | 如果将微生物细胞裂解，使其拟核（即染色体DNA）被抽提出来，通过溴化乙淀（ethidiumbromide，简称EB）染色并进行琼脂糖凝胶电泳，便可观察到释放到细胞外的染色体DNA。EB是一种扁平分子染料。可特异性插入DNA碱基对之间，在紫外线照射下，使DNA呈现荧光，因而可观察到凝胶中的染色体DNA，由于在提取过程中大分子染色体DNA的随机断裂，所以经凝胶电泳后形成的是一条不整齐的浓的荧光带。 用EB染色法进行的体外观察染色体DNA也分两步进行： 1.将细胞裂解后抽提染色体DNA； 2.通过含有EB的琼脂糖凝胶电泳在紫外光下观察染色体DNA荧光带。 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 大肠杆菌 试剂、试剂盒 | TE缓冲液10%SDS蛋白酶K（20mgml）5molLNaClCTABNaCI酚氯仿异戊酵（25:24:1）异丙酵70%乙醇溴酚蓝加样缓冲液TAE电泳缓冲液 仪器、耗材 | 台式高速离心机5ml塑料离心管真空干燥器
实验步骤 | 1.取4.5ml大肠杆菌过夜培养液于5ml塑料离心管中，12000r/min离心1～2min，弃上清。 2.将细胞沉淀悬浮于1.7mlTE缓冲液中，加入10%SDS90μl和20mg/ml的蛋白酶K9μl混匀，37℃保湿1h。 3.加入5mol/LNaCl300μl，充分混匀，再加入240μlCTAB/NaCl，混匀，置65℃水浴10min。 4.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混匀，12000r/min离心5min。 5.将上清水相转入另一洁净的塑料离心管中，加0.6倍体积的异丙醇使DNA沉淀下来。 6.快速离心数秒钟，弃上清，用70%的乙醇淋洗DNA2次，将DNA沉淀经真空干燥后溶于300μlTE缓冲液中。 用此法获得的染色体DNA可用于限制性酶切等分子生物学操作。 7.取少量（约3～5μl）提取的DNA样品（其余置于-20℃保存），加入3μl溴酚蓝加样缓冲液，混匀后上样进行琼脂糖凝胶电泳1～2h。琼脂糖中加有EB，在电泳过程中，EB将插入DNA分子中。 8.戴上一次性塑料手套（EB是强诱变剂）将凝胶取出置于紫外分析仪上观察染色体DNA荧光带。 注意事项 | 必须通过一块普通玻璃或戴上防护眼镜进行现察，以免损伤眼晴。 其他 |
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