2021-08-04【求助】在线求助，关于pGL 3.0 basic 和pRL CMV的问题

自己顶一下

我认为首先考虑Luminomiter有问题。Luc和hRluc的发光能保持1分钟左右。这一点Promega的说明书上有。而且我自己也发现，这两个萤光读数后，隔40秒再次读数，数值肯定下降。所以你所说的萤光数值持续升高10分钟肯定不正常。另外，作为内对照hRluc转染质粒量只有Luc的几十分之一，数值不可能那么高（如你观察到的8位数）。建议你从其他同事那里要几个可靠的样品，如肯定表达PGL3Control的阳性样品，还有转染PGL3basic的阴性样品，另使用一台Luminomiter作检测，并同你的样品作比较。pGL3Basic质粒会表现出一定的表达，这是因为PGL3basic骨架上的一些序列正好是某些真核转录因子的同源序列，可能结合一些转录因子，而引起下游基因的转录。而PGL4质粒中针对这一问题，对骨架序列进行了改造，请参考Promega公司的文件（pGL4说明书或是有一篇文献讨论pGL3和PGL4之间差异的提到了上面所说的）。但pGL3basic同control相比，表达水平的差别是数个数量级。祝好运！

我用96孔板先测了luciferase（timecurve)大约10分钟后数值降为最低。然后测pRLCMV，(timecurve)大约1分钟后基本测不出。Promega相关资料表明renilla发光12秒钟后持续下降。我很郁闷如何在12秒内完成加样和检测。一般luminometer一个孔一个孔读下来，完成96个孔绝对不止12秒。可能用injecter可以完成短时间加样，目前还不知道怎么设置。郁闷。请问楼上。测出luciferase和renilla后，如何做standalize？既然每一个孔细胞数目不同，那么所谓的renilla作为内参照是怎么处理数据的。希望得到您的帮助。to楼主，附件是Promega公司关于dualluciferaseassaykit使用一些的中文说明，希望对你有帮助。

想请问楼上几位,检测荧光用的都是用lumiometer吗?我们这里只有化学系有一台荧光分光光度计,但是它需要用激发光和吸收光.而Promega公司说,这种生物发光不需要激发,所以用那种仪器是测不准的.请问除了买lumiometer,还有什么其他的选择吗?检测同位素的单光子检测仪也可以的吧?有人用过吗

萤光是萤光素酶以ATP•Mg2+为共同底物催化萤光素的发光反应，不需要外加光源激发。荧光是荧光物质在外加光源的激发下发生能量变迁所发出的光。检测化学发光除了用luminometer外，一些比较先进的多功能酶标仪也具有检测化学发光的功能，检测同位素的液闪计数仪当然也可以的，只要稍微注意一下安全而已。我们老板有一台很高级的多功能酶标仪，可以用来检测化学发光，但本人由于在校外做实验，不可能拿着细胞急匆匆的赶回去用酶标仪检测啊，所以老板后来又买了一个Turner公司的TD20/20n的单管化学发光仪，用起来很方便。

Turner公司的TD20/20n的单管化学发光仪,这个需要多少钱啊用荧光检测仪可以调整参数用来检测萤光吗?

请问楼上各位战友,我正在做启动子连接pGL3basic的实验,我的pGL3basic上学期提质粒测序是对的,用KPN1和HIND3双酶切和各自的单酶切都是一条带,制了永久菌在-80度保存.这学期用永久菌划板提质粒,质粒两条带,结果质粒比4.8KB大很多,双酶切出现了4条带,单酶切各自出现了两条带,并且每条都与未切的质粒不同,我换了其他人的酶试过,还是同样的结果,我现在分析不出原因.不知道是哪里的问题?