一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

ddH₂O

2.酶和酶缓冲液

10XVent缓冲液

VentDNA聚合酶

3.核酸和寡核苷酸

dNTP，各20mmol/L

引物，可以与合成的DNA文库克隆位点两侧的载体序列退火

质粒DNA(见下面第1步）

4.特殊设备

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭

热循环仪

二、方法

1.混合以下组分。

10~50ng的质粒DNA

50pmol的各引物

5ul的10XVent缓冲液

dATP、dCTP、dTTP和dGTP,各0.5ul

1U的VentDNA聚合酶

用ddH₂0定容至50ul

下面的每种质粒载体，应该分别进行反应：

未消化载体

消化载体，但没连接

消化载体，并在无文库DNA情况下进行连接

消化载体，并用文库DNA进行连接

2.在一个热循环仪中，94°C将混合物预热20s。

3.按下面的参数进行30轮PCR循环。

94°C10s

55°C10s(或用引物的合适退火温度）

72°C15s

将最后一个循环的延伸时间延长至30s

4.冷却至4°C

5.取25ul的各反应产物，跑4%的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色分析（Sam-brookandRussell2001)。

三、分析

在图26-3所示的例子中，在连接之前进行线性化载体的PCR分析，显示载体是完全线性化的，因为没有得到起始载体对应的PCR产物（图26-3,第4泳道）。若不存在文库插入片段，连接载体的PCR结果显示发生了一定量的自连（图26-3,第2泳道），并显示存在一小部分的单切载体。然而，当载体与文库插入片段进行连接后，大部分的DNA产物与正确连接的文库DNA相对应，而没有与起始载体对应的PCR产物（图26-3,第3泳道）。当载体与插入片段连接后，检测不到起始载体对应的PCR产物，但仅用载体连接后能检测到(比较图26-3第2泳道和第3泳道），可以解释为文库DNA连接到了单切的载体上。这一副产物不会形成封闭的环状质粒，不能被克隆，也不会产生PCR产物。



在这个例子中，PCR作为一种重要的分析工具，能够很可靠地验证限制性酶切反应和连接反应。因此，研究者可以用正确的DNA进行文库构建的后续步骤，更可能最终获得高质量的文库。通过转化和扩增细菌，可以获得最终的文库，再用标准的程序对质粒DNA进行纯化（SambrookandRussell2001)。