一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

矿物油（可选）

2.核酸和寡核苷酸

来自方案3的cDNA

3.专用设备

热循环仪[推荐使用GeneAmpPCRSystem9600(Perkin-Elmer)，或者Mastercyder(EppendorfScientific)]

0.2ml薄壁PCR管

4.附加试剂

RNAspectraFluorescentmRNA差异显示系统（GenHunterF501~F510&R501-R510)，包括蒸馏水、10XPCR缓冲液（100mmol/LTris-HCl、pH8.4，500mmol/LKC1，15mmol/LMgCl₂,0.01%明胶）、FDDdNTP混合液（2.5mmol/L)、荧光锚定引物（FH-TUM)(2umol/L)以及任意引物（H-AP)(2umol/L)

二、方法

1.在不同的1.5ml离心管中，为每个FH-TUM锚定引物单独配制一个FDD-PCR主体混合液。

蒸馏水                                            91.8ul

10XPCR缓冲液                             18.0ul

FDDdNTP混合液                                          14.4ul

FH-T11M引物（M=G、A或C)                           18.0ul

TaqDNA聚合酶（Qiagen201207Valencia，CA)1.8ul

2.将热循环仪的程序设置为：94°C15s→40°C2min→72°C60s→40个循环→4°C平衡。
如果使用的不是推荐的热循环仪，那么将变性（94°C)"时间调整为30s。

3.各取16ul相应的FDD-PCR主体混合液，加到标记好的0.2ml薄壁PCR管中。例如，将8个管子标记为锚定引物FH-T₁₁G与任意引物H-AP1~8的组合，同样标记好所有的24个引物组合，包括FH-T11A与H-AP1~8和FH-T11C与H-AP1~8。

4.在每个0.2mlPCR管中，加入2.0ul相应的cDNA(来自方案3的RT反应）。

5.在每个0.2mlPCR管中，加入2.0ul相应的H-AP,混匀，总反应体积为20ul。如果需要，加入25ul矿物油。

6.将0.2mlPCR管放到热循环仪中，开始运行程序（见第2步）。完成后，反应产物在黑暗中-20°C保存。