第1阶段：通过PCR扩增DNA插入片段

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

dNTP溶液（包含所有4种dNTP,每种为10mmol/L)

2.酶和酶缓冲液

10XPCR缓冲液（40mmol/LTricine-KOH、22°C下pH9.2,3.5mmol/L乙酸镁,10mmol/L乙酸钾，75mg/mlBSA,或者厂商提供）

聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相当产品）

3.核酸和寡核苷酸

嵌套引物NP1*

嵌套引物NP2R*

*或者，载体上插入位点两侧的引物也可以用来进行PCR扩增插入片段。

4.培养基

LB-氨苄液体培养基

配制1L培养基，在950ml无离子水中溶解10g细菌用胰蛋白胨、5g细菌用酵母提取物、10gNaCl,用5mol/LNaOH调节pH到7.0。用无离子水将体积补到1L。在151bf/in2(llbf/in2=6894.76Pa)下高压灭菌20min。髙压灭菌后的培养基冷却后，加入氨苄西林，使终浓度为50ug/ml。

5.专用设备

热循环仪

在这一阶段，PCR在板子上进行，而且不得要以前的精确度，因而没有必要使用矿物油。

PCR管或反应板

6.附加试剂

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

7.细胞和组织

CDNA文库，存在于合适的菌株中，以菌落的形式生长在LB琼脂平板上

二、方法

1.从文库中随机挑取96个或384个白色的细菌菌落。

2.在一个PCR板上，每个菌落用150ulLB-氨苄培养基37°C下轻轻振荡培养，时间至少为4h(或过夜）。

3.配制用于100个或400个PCR的主体混合液。



4.将19ul主体混合液分装到每个管子或反应板的每个孔中。

5.从每个细菌培养液（见上面第2步）中，各取1ul,加到装有主体混合液的各PCR管或PCR板的各个孔中。

6.用下面的条件，不使用矿物油在热循环仪中进行PCR。



7.从每个反应中各取4ul在2%琼脂糖凝胶上分析。

第2阶段：斑点印迹分析

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

0.6mol/LNaOH(新鲜配制，或从浓的储存液中新稀释）

SSC，20X(1L配方：175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠，pH7.0)

0.5mol/LTris-HCl，pH7.5

2.核酸和寡核苷酸

PCR产物

3.专用设备

微量滴定板

尼龙膜

紫外交联装置（比如Stratagene的UVStratalinker)，或68°C烘箱

96孔或384孔复制器

二、方法

1.从每个PCR产物中，各取5ul,与5ul0.6mol/LNaOH混合。

2.从每个混合液中，各取1~2ul到尼龙膜上。这一步可以使用96孔或384孔复制器在用作PCR扩增的微滴定板相应的孔中蘸一下，再点到一块干的尼龙膜上。至少点2张同样的膜，分别用来与正向和反向消减探针进行杂交（方案1第3阶段）。强烈推荐点4张相同的尼龙膜。2张与正向和反向的消减DNA进行杂交，另外2张与最初的cDNA或基因组DNA进行杂交。

3.用0.5mol/LTris-HCl(pH7.5)中和2~4min,并用2XSSC洗涤。

4.用紫外交联装置（比如Stratagene的UVStratalinker)将DNA固定在膜上，68°C烘烤4h。