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部分分解多肽两端有关的 PCR 法筛选 PK120 基因实验一基本方案
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实验方法原理 | |
---|---|
实验材料 | PK-120 |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | PCR扩增仪 |
实验步骤 | 实验所需「试剂」具体见「其他」 1.引物设计 PK-120部分分解多肽氨基酸序列中,最长序列K-15,16为引物设计的依据: 1.1考虑全部编码的组合, 1.2考虑人编码的使用频率,设计PCR引物,正义链及反义链如用这些引物获得的PCR产物当中,50bp的产物为目的CDNA。 2.PCR扩增 从肝脏来源的poly(A)+RNA中,用GeneAmpRNAPCR试剂盒如以下所述,合成cDNA0.1ug的poly(A)+RNA中,加入5mmol/LMgCl2: 1×PCR缓冲液Ⅱ, 2mmol/LdNTPs, 1u的RNaseinhibitor, 2.5umol/Lrandomhexamers 2.5u反转录酶, 混匀,总体积为20ul。 在PCR扩增仪上反应,PCR参数为: 25℃10min, 42℃30min, 99℃5min, 25℃5min, 第1循环反应,合成cDNA。 在反应液中再分别加终浓度为2mol/LMgCl2,1×PCR缓冲液Ⅱ,加1nmol3"引物5"引物。混合,总体积为100ul。 94℃3min1循环。 94℃1min, 37℃~42℃,2min, 72℃,2min, 40循环。 72℃,7min,1循环。 3.凝胶电泳及提取DNA 纯化PCR产物后,在0.25×TBE溶液中,进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量标准使用限制性酶Msp1消化的质粒pBR322。电泳结束后,凝胶经溴化乙锭染色,紫外照射,观察到50bp的PCR产物。将这50bp的条带切下,在抽提液中,室温放置过夜之后1200r/min4℃离心10min,回收上清。反复操作两次,用乙醇沉淀2次,用TE液溶解,上样Sephadex-50柱,再用乙醇沉淀洗脱组分,沉淀悬浮于TE溶液中。 4.测定碱基序列 抽取提出的PCR产物用PCRⅡ载体亚克隆,测定碱基序列。其结果以肝脏polymRNA为模板,据引物S15-i和A15-i扩增的50bp的PCR产物序列,和从氨基酸序列预测的碱基序列完全一致。表明这是编码母的部分分解多肽的cDNA。 |
注意事项 | |
其他 | 试剂: Sephadex-50 GeneAmpRNAPCR试剂盒 合成寡聚核苷酸用BIO-SYNTHESIS,INC公司产品合成寡聚核苷酸 抽提液 750mmol/L醋酸铵-10mmol/L醋酸镁-0.1mmol/LEDTA-0.1%SDS-1%TE饱和酚 25ug/ml酵母tRNA 其他他试剂均为市售 |