第一阶段 诱饵-LexA融合蛋白的鉴定

材料

缓冲液和溶液
将贮存液稀释到适当浓度。

2XSDS凝胶上样缓冲液
100mmol/LTris-Cl(pH6.8)
200mmol/L二硫苏糖醇
4%SDS(电泳级）
0.2%溴酚蓝
20%甘油
不含二硫苏糖醇的SDS凝胶上样缓冲液可在室溫存放。缓冲液用前在1mol/L贮存液中加入二硫苏糖醇。

凝胶

SDS聚丙烯酰胺凝胶
制备蛋白质分离用的SDS聚丙烯酰胺凝胶，请见附录18。

核酸和寡核苷酸

编码目标蛋白（诱饵）的靶DNA

抗体

抗LexA的单克隆抗体（CLONTECH)或抗LexA的多克隆抗体（Invitrogen)或抗靶蛋白质融合域的特异性抗体（如果有的话）。

培养基
酵母培养基的成分请见附录2。

CM选择性培养基
用表18-3估计褥要培养基的量，用表18-4制备必需的选择性培养基。
商品销售的无氧基酸的酵母氮源（YNB)有含硫酸胺和不含硫酸胺两种。表18-4假定YNB含硫酸胺。如杲盛酵母氮源的瓶子上指示加1.7g/L来配置培养基,它就不含有硫酸胺，应当在每升培养基中加5g硫酸胺。

酵母选择性X-gal培养基
1.按表18-4,以900ml水制备基础培养基。将基本培养基高压灭菌并冷却到55°C。
2.在另一个瓶子中，以100ml蒸馏水溶解7g磷酸氢二钠和3g磷酸二氢钠，然后髙压菌。
3.将两种高压灭菌的溶液混合在一起，并加入0.8ml浓度为100mg/ml的X-gal(在N,N-二甲基甲酰胺中),铺平板。

YPD培养基
20g蛋白胨
10g酵母提取物
20g葡萄糖
20g琼脂（如果用于平板）
加1L蒸馏水并高压20min。铺板前将高压灭菌的培养基冷却到55C。

专用设备

干冰/乙醇浴锅
请见步骤13。

平头牙签，灭菌的
灭菌时，将标准牙签转移到250ml烧杯中，用铝铂纸包盖烧杯，在标准干燥条件下高压灭菌。

预设到100°C的加热包或热循环仪，或沸水浴。

附加试剂

本方案第1步需要亚克隆试剂，列在第1章方案17。
本方案第2步需要酵母转化试剂，列在Spector等的文献中（1998,第21章）。
本方案第17步需要免疫印迹试剂，列在附录8。

载体和酵母菌

选择和扩增载体用的酿酒酵母菌（请见表18-6)

带LexA(请见表18-1)和活化域融合序列（请见表18-2)的载体，以及LacZ报道子质粒（请见表18-5)。












方法

诱饵-LexA融合蛋白的构建

1.将编码诱饵蛋白的靶DNA克隆到LexA融合载体（如，pMW101或pMW103)的多聚接头处，以合成一种框架内的LexA融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为pBait。

2.采用下列LexA融合基因和报道质粒的组合，建立一系列EGY48lexAop-LEU2选择的转化酵母菌：

a.pBait+pMW112(活化测定）

b.pSH17-4+pMW112(活化的阳性对照）

c.pRFHMl+PMW112(活化的阴性对照）

d.pBait+pJK101(抑制/DNA结合测定）

e.pRFHMl+pJK101(抑制的阳性对照）

f.pJK101单独（抑制的阴性对照）

每种质粒功能的描述，请见表18-1和18-2。

3.将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上:CM(Glu)-Ura-His(针对质粒组合a~e)或CM(Glu)-Ura(针对质粒组合f)。将培养板在37°C培养2~3d以选择含有质粒的转化酵母克隆。
如果克隆在3~4d内没有出现，或只有很少量的克隆（<20),则应重新转化。

4.制备转化子的母板，从中可按步骤5~9描述的那样，对具有lacZ和LEU2报道子活化表型的特异性克隆进行分析。

活化和抑制活性的鉴定：X-gal和Leu2表型的分析

步骤5~9用于测试诱饵-LexA融合蛋白质的转录激活性，并证实诱饵的融合物不影响DNA结合活性（抑制分析的图示请见图18-9)。对步骤2中转化的每种质粒组合，挑选几种单个克隆做分析。这对于某些诱饵的构建非常重要，因为蛋白质表达水平在不同克隆中会有变化，正如活化两种报道子转录激活的表观能力有变化一祥。在第一阶段结束处的替代方案中，给出了一种替代步骤5~8的、通过氯仿交叠分析来测试活化的方法。

5.从a~f的每个转化（取自步骤2)中，用无菌的平头牙签挑选约8个克隆。用干净的牙签触及克隆以挑取细胞，使它们在新鲜的CM(Glu)-Ura-His或CM(Glu)-Ura板上的小格内成为lcm长的线。通常可在一个板上形成多达60~80条线。将平板在30°C孵育过夜。

6.第二天，从两个母板中再划线到下列每个板上：
转化a~f:划线到CM(Glu,X-gal)-Ura和CM(Gal，X-gal)-Ura上
转化a~c:划线到CM(Glu)-Ura-His-Leu和CM(Gal)-Ura-His-Leu上



7.在30°C将平板孵育到4d。

8.对抑制和激活性进行分析；

a.对于抑制活性，在划线接菌约12~24h时观察X-gal表型。

b.对于激活性，在划线接菌18h到72h之间观察X-gal表型。

c.在48h到96h之间观察Leu2表型。在表18-7中给出了具有良好表现的诱饵所应得的预期结果，并总结如下。
（1）最好在接种到CM(Gal,X-gal)-Ural2~24h,应当能看出d+e转化比f的颜色浅。
在接种到CM(Glu，X-gal)-Ura48h,b转化应当是亮蓝色,c应当是白色，而a应当是白或很淡的蓝色。
（2）在接种后48h,在CM(Glu)-Ura-His-Leu或CM(Gal)-Ura-His-Leu上，b转化应当同在CM(Glu)-Ura-His母板上一样很好生长，而a和c应当不生长。
（3）最理想的是,a转化在接种后96h内仍没有明显的生长。


9.基于抑制和激活分析的结果，选择适当的候选克隆。



检测诱饵蛋白质表达

10.在母板上，标记要分析蛋白质表达的克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌培养，供文库转化用（在第二阶段中）。

11.对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子。还要包括两个作为蛋白质表达阳性对照的转化子（如pRFHMI)。

a.用无菌牙签从CM(Glu)-Ura-His母板上挑取克隆，于CM(Glu)-UraHis液体培养基中生长。如果带手套，牙签可落入培养管并留在那里，不用担心污染。
b.在滚筒或其他摇动仪器上30°C培养过夜。
c.早晨，将达饱和的培养液稀释到含3~5mlCM(Glu)-Ura-His的新培养管中，使初始密度OD₆₀₀约为0.15。30°C培养4~6h,直到光密度大约增大两倍（OD₆₀₀约0.45~0.7)。

12.转移1.5ml培养液到一个微量离心管中，在离心机上以最大速度离心细胞3~5min。可见沉淀的体积应为2~5ul。小心倾去或吸除上清。
一些（尽管不是所有）LexA融合蛋白随生长静止相启动，表现出可检测的蛋白质水平急剧增加。因而，不需要为了期望増加分析蛋白的产率而使培养进行到饱和。
如果预期要进行一轮以上的分析，在此阶段冰冻双份样品可能会有好处。

13.加入50ul的2XSDS凝胶加样缓冲液到离心管中，快速震荡离心管以悬浮沉淀。立即将离心管放在干冰上或干冰/乙醇浴中。
样品或即刻用于分析，或在-70°C冰冻，这样至少可以保持稳定4~6个月。

14.将样品从干冰或-70°C直接转到100°C,并煮沸5min。
设定到100°C的PCR仅最方便，当然也可用水浴或加热。

15.将样品在冰上冷却并在离心机上以最大速度离心5~30s以沉淀大的细胞碎片。加20~50ul样品到SDS聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中。

16.电泳并分析产物以确定预期大小的诱饵蛋白是否以合理的水平表达。

17.为防止可能出现的问题，通过免疫印迹来分析含LexA融合的诱饵的酵母裂解液（请见这一步的注解)。
免疫印迹可按附录8描述的进行。LexA融含物可用计对融合域的抗体来检如果没有，也可用抗LexA的抗体替代。
确定一种诱饵蛋白的重要一步是直接分析诱饵是否可被检测到，以及诱饵大小是否正确。在多数情况下，上述两项都是正确的。然而，一些蛋白质（特别是融合域在约60~80kDa或更大时）或者合成水平很低，或者在翻译后被蛋白酶剪断。这两种结果都可能导致在文库筛选中出现问題。低水平表达以及在转录活化分析中无表观活性的蛋白质,可在亮氨酸选择下上调到较高水平，然后突然显示转录活化的高背景。在蛋白质由于发生蛋白质水解而剪断时,对于仅与较大诱饵的氨基端融合的LexA来说，筛选仍然可以进行。





第二阶段 筛选一个相互作用子

材料

缓冲液和溶液
将贮存液稀释至适当的浓度

二甲基亚砜（DMSO)

乙醇
可选择，请参见步骤9。

冻存转化体用的无菌甘油溶液
65%无菌甘油
0.1mol/LMgS0₄
25mmol/LTris-Cl(pH8.0)
TE(pH7.5)（无菌）
TE(pH7.5)，含0.1mol/L乙酸锂
TE(pH7.5),含40%PEG4000和0.1mol/L乙酸锂（无菌）

核酸和寡聚核苷酸

载体DNA
剪切处理的鲑精DNA为典型的常用载体。髙质量的DNA是非常重要的。使用低质量的制品可能降低1~2个数量级的转化频率。生产髙质量鲑精DNA的简便方法请参见Schiestl和Gietz(1998)的方法和第6章方案10,也可选择许多公司出售的这种商品。

相互作用筛选文库

培养基

CM选择培养基
利用表18-3估计所需培养基的量，根据表18-8制备所需的选择培养
无氨基酸的酵母(YNB)分含或不含硫酸铵两类，均有销售。表18-8中假定YNB中含有硫酸铵。如果酵母氮源包装瓶上说明制备培养基需加1.7g/L酵母氮源，那么它躭不含有硫酸铵，配制时每升培养基中应加入5g硫酸铵。

酵母选择X-gal培养基
1.按照表18-8在900ml水中制备基础培养基，高压灭菌后冷却至55°C。
2.在另一个瓶于中，将7g磷酸氢二钠和3g磷酸二氢钠溶于100ml蒸馏水中，高压灭菌。
3.将两种髙压灭菌溶液混合在一起，加入0.8ml浓度为100mg/ml的X-gal(格于N,N-二甲基甲酰胺),铺制平板。

离心机和转子

SorvallGSA转子或等同物
SorallRT6000离心机和H1000B转子或等同物

专用设备

选择培养基用培养极（24cmX24cm)(见表18-3)
这些培养板非常昂贵，但是可以重复使用很多次（见步骤9)。

Falcon管（50ml，无菌）

玻璃珠（直径0.45mm,无菌；Sigma)
可选，请见步骤9。

加热块，预设至42°C

微量滴定板（96孔）
可进，请参见步骤21。

多道移液器或接种多支管/蛙形器（例如DankarScientific)
可选，请参见步骤21。

用于多菌落转移的蛙形器可以购买或自己制造也很容易；蛙形器的所有辐条都有一个平坦的表面且辐条末端保持水平是很重要的。蛙形器可以通过高压或乙醇灼烧来灭菌。

载体和细菌菌株或酵母菌株

携带表达诱饵蛋白质和lexAop/lacZ报道子的载体的酿酒酵母候选菌株（来自第—阶段）。



方法

转化文库

1.挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和lexAop-lacZ报道子的酵母菌落，接种于20mlCM(Glu)-Ura-His液体培养基中，30°C摇动过夜培养。
重要：应该在用文库重新转化之前7~10d内，将诱饵蛋白和lexAop-lacZ报道子质粒转化到酵母中。在整个试验过程中始终保持无菌条件非常重要。

2.稀释20ml的过夜培养物于300ml的CM(Glu)-Ura-His液体培养基中，以使稀释后培养液的OD₆₀₀约为0.10~0.15。在旋转摇床上30°C摇动培养，直到该培养物增殖1~5倍，OD₆₀₀达到0.50左右。

3.把培养物转移至1个250ml的无菌离心瓶中，室温下1000~1500g(使用SorvallGSA转子2500~3000r/min)离心5min。移去上清，加入30ml无菌水，在工作台上轻轻拍打离心瓶重新悬浮沉淀，转移混合物至1个50ml的无菌Falcon管中。

4.1000~1500g(使用SorvallGSA转子2500~3000r/min)离心酵母细胞5min。倒掉水，重新悬浮酵母细胞于1.5ml含0.1mol/L乙酸锂的TE(pH7.5)中。

5.在30个1.5ml的无菌小离心管中分别加入1ug的文库DNA和50ug刚刚变性的载体DNA。马上在每个小离心管中加入50ul的酵母悬浮液（来自步骤4)。
—个成功的转化试验，每微克文库DNA应该产生约105个转化子。使用小体积的DNA(最好毎个转化管中少于10ul)通常可以提高转化效率。
平行地进行多份小量的酵母转化有利于喊少污染的概率，而且这种方法与在较少试管中采用较大体积相比，经常可以得到显著更髙的转化效率。每份感受态酵母细胞悬泮液中不要加入过多的转化文库DNA,否则每个感受态细胞可能吸收多个文库质粒，使后面的分析复杂化。

6.在每管细胞悬浮液中加入300ul含40%PEG4000和0.1ml/L乙酸锂的无菌TE(PH7.5),轻轻翻转试管若干次使混合（不要振荡)，30°C培养30~60min。

7.每个试管中加入40ulDMSO,翻转混匀悬浮液，在42°C的加热块上加热10min。

8.按照下述步骤将转化混合物铺平板：

其中的28管只用于产生转化子

a把每管中的混合物加到24cmX24cm的CM(Glu)-Ura-His-Trp选择平板上。
b.将细胞涂匀，并将平板置于30°C孵育直到菌落出现。
每个24cmX24cm平板需要250~300ml的培养基，应该在倒制平板后室溫干燥1~2d再使用。为了减少污染的机会，倒制平板后需用火烘烤平板表面。一些研究人员采取了另外的处理方法：打开平板，翻转盖子放置在标准组织培养超净台内，紫外线照射约10min。

剩余2管用来评价转化效率

a.从每个管中取350ul混合物加却24cmX24cm的CM(Glu)-Ura-His-Trp平扳上。
b.铺平细胞，30°C培养平板直到菌落出现。
c.吸取每管中剩余的40ul混合物用无菌的TE(pH7.5)或水做一系列的1:10稀释（至少3次)。
d.每份稀释液吸取100ul铺在100mmCM(Glu)-Ura-His-Trp平板上，30°C培养平板直到菌落出现。
分析稀释度能够大致估计所得转化子的数目。100mm指示平扳上预测增加的转化子菌落数目偶尔与24cmX24cm平板上的数目有显著的不同，尤其是不同批次的平扳之间。一个成功的转化实验中每个大平板上应该产生20000~40000个菌落。

初级转化子的收获和富集

步骤9~14提供代表全套初级转化子的冻存物，可用于后面的筛选。在这个实验中，从初级转化子（约10⁶个细胞）制备同质的细胞悬液，每一份都可以用来在选择培养基上进行平板筛选。这项技术代表了更加常规的转移酵母的方法（例如：复制平板培养），它转移了如此大量的细胞，以至于在选择培养基上可以观察到某种程度上导致虚假背景的细胞生长。如果在平板上观察到可见的霉菌斑或其他的污染，那么在收获文库转化子之前，用无菌刀片小心地切去污染物及其周围部分。
在步骤9中，第一种方法（揺动法）操作起来很快，可以在同一天进行文库的诱导和选择培养基上的筛选，它也缩短了平板打开的时间，从而避免源于空气传播的霉菌和细菌的污染。大约三分之一的酵母细胞悬浮液将留在平板上；然而正常情况下所使用的量不超过收集悬液的2%，所以保证酵母菌落以大致相等的概率从平板上洗脱是很重要的。步骤9中的第二种方法（刮擦法）节省试剂，而且可以方便地在已经切掉霉菌和污染物的平板上使用。

9.使用下列方法之一收获文库。

1)通过摇动法收获文库

a.分别在5个含有转化子的24cmX24cm平板上倒入10ml无菌水和大约30粒无菌玻璃珠。

b.把5个平板叠放在一起，紧握平板，猛烈地摇动平板直至菌落重新悬浮（1~2min)

c.用无菌移液管从每个平板中吸取5ml酵母悬液（倾斜平板)把细胞悬液集中在50ml的无菌锥形管中。

d.继续下面的5个平板，重复步骤a~c。连续从30个平板中收获酵母细胞，结果得到总体积为150ml的酵母悬液，保存在3个50ml管中。
相同的玻璃珠可以转移到新的平板中，也可使用新的玻璃珠。同时洗脱的平板可以超过5个，只要手可以握住摇动即可。
平板可以重复使用许多次。收获酵母细胞后，弃去残余的琼脂，冲洗平板，用乙醇擦拭，暴露于紫外灯下照射10min,存储备用。

2)通过刮擦法收获文库

a.戴着手套，把30个含有转化体的24cmX24cm平板放在4°C环境中使琼脂变硬（通常需要2h甚至过夜）。

b.把一个显微镜载玻片在乙醇中浸泡，然后灼烧消毒，用这个玻片轻轻地把酵母细胞从转化平板上刮至50ml的锥形管中。不断地重新灼烧玻片或换用新的玻片（每5~10个平板)。
全部30个平板上的细胞通常汇集在一或两个50ml锥形管中。
平板可以重复使用许多次。收获酵母细胞后弃去残余的琼脂，冲洗平板，乙醇擦拭，暴露于紫外灯下照射10min，存储备用。

10.如果需要，在每个装有酵母细胞的锥形管中加无菌TE(pH7.5)或无菌水至40~45ml,振荡或翻转试管悬浮细胞。

11.使用台式离心机1000~1500g(使用SorvallH1000B转子2200~2700r/min)室温下离心试管5min,弃去上清。

12.重复步骤10和11。

第二轮洗涤后，源自1.5X10⁶个转化体的细胞沉淀总体积应为25ml。

13.重新悬浮紧的细胞沉淀于一倍体积的无菌甘油溶液中，合并不同管的内容物，彻底混合。

14.分别转移1ml的细胞混合物于一系列无菌小离心管中，-70°C冻存（至少1年内细胞保持稳定）。
如果直接在选择培养基上进行平板培养（完成需要5h)，留一份不要冻存，进行下面的步骤。假设未冻存培养物的存活力100%,—般情况下，酵母冻存时间少于一年，预期存活力将大于90%。如果出现意外情况（例如：特别是在选择培养基上铺平板培养冻存细胞后没有得到菌落)，通过在CM(GlU)-Trp-His-Ura上进行一系列的有限稀释测量冻存细胞的存活力。

相互作用蛋白的筛选

转化文库的每一份铺在亮氨酸缺乏的选择培养基上来检测其能否促进LEU2转录。并不是所有含有相互作用蛋白质的细胞在亮氨酸缺乏的选择性培养基平板上都以100%的效率生长（Estojaketal.1995)。为了增加检测到相互作用的概率，转化文库中获得的每一个克隆都应该在选择培养平板上出现3~10个能存活的酵母细胞。例如：最初得到5x10⁵个克隆，1.5x106~5x10⁶个细胞就应该涂布在2~5块平板上。虽然这样操作可能导致过多地分离到相同的cDNA,但是它帮助我们保证了所有的初级转化子在选择培养基平板上至少呈现1个细胞。事实上，在一批相对较少的阳性克隆中，一条相同的cDNA的重复分离可被看作为一个特殊蛋白质间相互作用的标志。

15.解冻一份转化文库酵母细胞（来自步骤14)，用CM(Gal-Raff)-Ura-His-Trp培养基按1:10稀释，30°C摇动培养酵母细胞4h来诱导文库中GAL1启动子的转录。

16.在适当数量的100mmCM(Gal-Raff)-Ura-His-Trp-Leudropout平板上分别培养10⁶个细胞（或50ulOD^₆₀₀为1.0的培养物）。
重要：每个平板105个细胞为通常有效使用的最髙平板密度。更髙密度平板培养（例如：3X106。可能产生酵母细胞间的共栖现象，导致很高的背景生长。

17.30°C培养平板5d。
决定于所使用的单个诱饵蛋白，好的阳性相互作用单元候选菌通常在5d内长出克隆，大多数克隆在4d间出现。

18.观察平板的生长，出现克隆时对其加以标记。
一个好的策略（特别每生长出大量克隆时）是每天现察平板，并不需要马上挑取克隆。而是第一天肉眼可以看到的充隆用实验室记号笔以一个特定顔色的点在平板上标记它们的位置（例如：第3天为红色）。每一天以不同的颜色笔标记刚刚长出的克隆（第4天为蓝色等）。

19.第五天，形成一个按每天出现的不同克隆分组的主板(CM[Glu]-Ura-His-Trp)。如果出现许多明显的阳性克隆，就有必要按照第二天、第三天和第四天出现的克隆分别生成一些单个的平板。为了为后面的步骤制作一个阴性对照，从检测酵母细胞存活力的平板上随机挑取3~5个克隆（请参见步骤14的说明），在测试主板上平行划线培养。如果在后面的实验步骤中使用多支管/蛙形器，要确信在合适的方格网中划线以保证菌落与蛙形器上的辐条相对应（请参见图18-10)。

20.30°C孵育平板直到斑点/菌落形成。



阳性相互作用的初次确定：β-半乳糖苷酶活性和亮氨酸需求的检测步骤21和22检测lexAop-LEU2和lexAop-lacZ报道基因的半乳糖诱导的转录活化。两个报道甚因在半乳糖特异诱导的条件下同时表达，表明这种转录表型的出现是因为文库编码蛋白质的表达，而不是酵母宿主菌的突变。含有葡萄糖和亮氨酸的母板可用来提供检测克隆。

21.测定转录活化。
这个实验可以利用牙签重新划线培养或利用多支管/蛙形器来进行，在分析大量阳性克隆时，多支管/蛙形器是非常有用的（有关蛙形器的详细情况请参见图18-10)。

1)通过直接划线培养测定

a.使用一个平头牙签分别在下面的4个平板上复制和主板上相同的栅格。使用相同的牙签在四个平板上划线培养单克隆，尽量在含有X-gal平板上划制粗的酵母线条，而在亮氨酸缺乏的平板上划制细的酵母线条。
CM(Glu/X-gal)-Ura-His-Trp         1个平板
CM(Glu/Raff/X-gal)-Ura-His-Trp    1个平板
CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu            1个平板
CM(Glu/Raff)-Ura-His-Trp-Leu      1个平板

b.平板在30°C培养3~4d。
X-gal平板在48h之内即会产生结果，最强的相互作用甚至18h就会长出斑点。48h到72h之间亮氨酸平板上不同的生长状况通常很明显。

2)使用多支管/蛙形器测定

a.在96孔微量滴定板上的48个孔中加入25~30ul无菌水。

b.使用蛙形器从预先画好栅格的主板上将菌斑同时转移至微暈滴定板的孔中。轻轻摇动滴定板。

c.再次使用蛙形器从微量滴定板中将酵母转移至下面的平板上。这种方法可以把大致相同数量的细胞转移到同一块平板上。
CM(Glu)-Ura-His-Trp                2个平板
CM(Gal)-Ura-His-Trp                1个平板
CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu           1个平板
CM(Gal/Raff)-Ura-His-Trp-Leu     1个平板

d.平板在30°C培养3~4d。平板在培养1d后，采用氯仿覆盖法（请参见第一阶段结束处的替代方案：“通过氯仿覆盖分析屮半乳糖苷酶活性”)，使用一个CM(Glu)-Ura-His-Trp平板和一个CM(Gal)-Ura-His-Trp平板测定lacZ报道基因的活化。

e.继续监控菌斑的生长：通常在48h到72h之间，在亮氨酸平板上的生长与在亮氨酸缺乏平板上的生长将产生明显的不同。第二块CM(Glu)-Ura-His-Trp平板可作为新的主板。

22.解释结果。如果具备下面的条件，菌落和它们包含的质粒被认作为第一轮的阳性充隆：
(1)在CM(Gal)-Ura-His-Trp平板上的培养物X-gal分析呈现蓝色。
(2)在CM(Glu)-Ura-His-Trp平板上的培养物X-gal分析呈现白色或仅是浅蓝色。
(3)菌落在CM(Gal/Raff)-Ura-His-Trp-Leu平板上生长良好。
(4)菌落在CM(Glu)-Ura-His-Trp-Leu平板上生长缓慢或根本不能生长。



第三阶段 阳性相互作用的再次确定

材料

缓冲液和溶液

乙酸铵（7.5ml/L)

氯仿

乙醇

异丙醇

裂解液
酶解酶100T以2~5mg/ml溶解于拯救缓冲液中或β-葡糖醛酸酶100000单位/ml(Sigma）按1:50稀释于拯救缓冲液中每次使用均需配置新鲜的溶液。

酚（早衡至pH8.0)

拯救缓冲液
50mmol/LTris-Cl(pH7.5)
10mmol/LEDTA
0.3%β-巯基乙醇
每次使用均需配置新鲜的溶液。

SDS(10%,m/V)

STES裂解液
100mmol/LNaCl
10mmol/LTris-Cl(pH8.0)
1mmol/LEDTA
0.1%(m/V)SDS

TE(pH8.0)

酶和缓冲液

限制性内切核酸酶EcoRI，XtoⅠ，HaeⅢ

凝胶

琼脂糖凝胶
请参见步骤5。

培养基

CM选择培养基
利用表18-3估计所需培养基的量，并根据表18-9制备所需的选择培养基。
无氨基酸的酵母氮源（YNB)分含或不含硫酸铵两类，均有销售。表18-9中假定YNB中含有硫酸铵。如果酵母氮源包装瓶上说明制备培养基需加1.7g/L酵母氮源，那么它就不含有硫酸铵，配制时毎升培养基中应加入5g硫酸铵。



含50ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板

细菌基本培养基（色氨酸缺乏）

制备下列高压灭菌贮存液：
1.20%(m/V）硫酸镁
2.4mg/ml尿嘧啶
3.4mg/ml组氨睃
4.4mg/ml亮氨酸
5.20%(m/V)葡萄糖

制备下列过滤除菌溶液：
6.50mg/ml苄青霉素
7.1%盐酸硫胺素

分别高压灭菌下列两种溶液：
8.15g琼脂溶解于800ml蒸馏水中
9.10.5g磷酸氢二钾

4.5g磷酸二氢钾
1g硫酸铵
0.5g柠檬酸钠
160ml蒸馏水

将溶液8和9冷却至50°C，混合。迅速加入1ml的溶液1.10ml的溶液2，10ml的溶液3，10ml的溶液4,10ml的溶液5,lml的溶液6，以及0.5ml的溶液7。彻底混合终溶液，马上倒制平板。

酵母选择X-gal培养基
i.按照表18-9所述，在900ml水中制备基础培养基，高压灭菌后冷却至55°C
ii.在另外一个瓶子中，7g磷酸氢二钠和3g磷酸二氢钠溶于100ml蒸馏水中,高压灭菌。
iii.把两种高压灭菌溶液混合在一起，加入浓度为100mg/ml的X-gal溶液（溶于N,N-二甲基甲酰胺）0.8ml,倒制平板。

离心机和转子

SorvallRT6000离心机，H1000BMPC和H6000AMPC转子（离心微量滴定板用）

专用设备

玻璃珠（直径0.45mm,无菌；Sigma)

微量滴定板（24孔或96孔[可选])

重复用移液管
可选，请参见步骤1。

附加试剂

此方案的步骤2需要第1章方案26中列出的电穿孔试剤。
此方案的步骤3和4需要第1章方案1中列出的小量质粒DNA制备用试剂。
此方案中步骤10需要第4章方案13中列出的酵母DNA测序试剂。

载体、细菌和酵母菌株

适用于电穿孔的大肠杆菌DH5a或大肠杆菌KC8(pyrFleuB600trpChisB463;CLONTECH)
请参见第l章，方案26。

非特异性诱饵质粒
请参见步骤6说明。

PMW112，pRFHM-1

pBait(来自第一阶段）

在CM(Glu)-Ura-His-Trp主极上生长的具适当表型的酵母克隆（第二阶段步骤21已鉴定）

酵母菌株EGY48

方法

阳性质粒的分离提供了两种分离离散文库质粒的方法。分离少量的菌落时，将细胞在SDS中裂解；分离大量的菌落时，细胞用酶解酶（zymolyase)裂解。

(1)从阳性菌落中制备细胞裂解物

1)少量菌落的分离
一般来讲，即使阳性菌落的数目数以百计，一些研究人员也宁愿用这种方法去逐步处理最初得到的全套阳性菌落，而在同时处理约24~36个或更少的菌落时，这种方法则是最为好用的。在通常的情况下，利用这个方案结束处的替代方案从普通生长的阳性菌落中区别出单一序列，不失为一个较为有效的方法。

a.从CM(Glu)-Ura-His-Trp主板开始（第二阶段步骤21),挑取在选择培养基上呈现合适表型的菌落至5ml的色氨酸缺乏的葡萄糖培养基中，30°C过夜培养。在这种情况下省掉-Ura-His筛选可以促进非文库质粒的丢失，使分离希望得到的文库质粒变得更为容易。

b.室温下使用小型离心机以最大转速离心毎个培养液中的1ml培养物1min,在200ul的STES裂解液中重新悬浮沉淀，加入100ul直径0.45mm的无菌玻璃珠，剧烈振荡试管lmin。

c.每个试管中加入200ul平衡酚，再次剧烈振荡1min。

d.室温下使用小型离心机以最大转速离心乳浊液2min,分别把水相转移至新的小离心管中。

e.每个水相中加入200ul的平衡酚和100ul的氯仿，振荡30s。室溫下使用小型离心机以最大转速离心乳浊液2min,分别把水相转移至新的小离心管中。

f.每个水相中加入两倍体积（400ul)的乙醇，翻转混合，-20°C冷冻试管20min,4°C条件下使用小型离心机以最大转速离心15min来回收核酸。

g.弃去上清。用冷的70%乙醇洗涤沉淀，真空条件下使沉淀大致干燥后，在5~10ulTE(pH8.0)中重新悬浮每份沉淀。进行步骤2。

2)大量菌落的分离
下面制备多批DNA的实验方法是由SteveKron(芝加哥大学）建立的，在它是对ManuelClaro(巴黎基因技术分子实验室）最初建立的实验方案的一种放大。需要带有平板固定器（或托盘、支架）的冷冻离心机和可以重复使用的移液管。

a.在24孔微童滴定板的每个孔中加入2ml2xCM(Glu)-Trp培养基。用牙签从主板上挑取假定的阳性克隆到微量滴定板的孔中（第2阶段步骤21),30°C摇动微量滴定板培养过夜。
使用2X基础培养基增加了酵母的产通常可以方便地处理4个平板，并在一个离心机中同时离心。

b.使用带有平板支架的离心机，4°C、1500g(使用SorvallH1000BMPC转子3000r/min)离心5min。用手甩动平板去掉上清液，平板正面向上放置，摇动或轻轻振荡平板使细胞沉淀重新悬浮于保留的培养液中。每个孔中加入1ml水轻轻播动平板。
加入新的溶液之前，细胞沉淀最容易重新悬浮于残余的液体中。可以使用重复用移液管添加溶液。

c.如步骤b般离心，甩掉上清液，重新悬浮细胞沉淀于残留的上清液中，加入lml的拯救缓冲液。

d.如步骤b般离心，甩掉上清液，重新悬浮细胞沉淀于平板上少量的残留上清液中，每个孔中加入25ul的裂解液，摇动或振荡平板，在旋转摇床上37°C培养平板（需加盖）约1h。
裂解液使用前不需要完全溶解。经过1h，酵母细胞凝结为白色的沉淀时，即明显可见裂解现象。酵母菌株对裂合酶的敏感性各不相同。如果裂解现象出现得很快，那么就使用较少的裂合酶。如果裂解处理的时间过长,过多的部分溶解细胞垫将可能污染最后的材料。可以通过在相差显微镜下检査细胞来判断裂解情况。活细抱是带有黑的晕圈的白色，死细胞是均匀的灰色。裂解会把细胞中的顆粒内容物释放到培养基中。一旦细胞大部分都变成灰色并且许多细胞已经破裂，即可假定为许多质粒已经释放了出来。

e.每个孔中加入25ul的10%SDS。摇动平板完全溶解沉淀。室温下把平板在桌面上放置lmin。1min后，平板上的孔中应为清亮的、稍微黏稠的溶液。

f.每个孔中加入l00ul的7.5mol/L乙酸铵。轻轻振荡平板，然后-70°C或-20°C放置15min直到裂解物被冷冻为止。
乙酸盐的加入导致了细胞碎屑和SDS块状沉淀的形成。冷冻步骤促进了大扬杆菌转化抑制物的去除。

g.从冰箱中取出平板。一旦开始融解，4°C、3000g(使用SorvallH6000AMPC转子3800r/min)离心15min,转移得到的100~150ul的清亮上清液至新的24孔板中。
要点：一般来说，沉淀材料对上清液的某些污染不能避免。然而为了保证纯度，最好牺牲部分产物。

h.每个孔中加入约0.7体枳的异丙醇，摇动平板混合溶液，室溫下沉淀核酸2min。按照步骤g离心，用手甩动平板去掉上清液。
异丙醇加入后马上出现浑浊的细小沉淀。

i.每个孔中加入1ml70%冷乙醇，晃动平板。然后4°C、3000g(使用SorvallH6000AMPC转子3800r/min)5min,用手甩动平板去掉上清液，翻转平板，让孔印在纸巾上，让平板在空气中干燥。

j.每个孔中加入100ul的TE(pH8.0)。晃动平板，然后放在桌面上放置几分钟，直到沉淀完全掖解。把制备品转移至小离心管或96孔板孔中-20°C保存。进行步骤2。
取每份所得制备品来通过电穿孔转化适宜的大肠杆菌。如果没有得到足够的菌落，重新沉淀DNAs,再溶解于20ul而不是100ul的TE中,浓缩DNA贮存液。

转化至大肠杆菌中

如果诱饵蛋白被克隆在携带氨苄青霉素抗性标志的特异性lexA融合质粒（表18-1)中，一定比例的大扬杆菌DH5a转化子将不含这个文库质粒。解决这个问题的一个方法是分析每个DNA制备品的多个转化子。另一个行得通的方法是通过一株具有trpC突变的大肠杆菌传递质粒，通过酵母TRP1基因补足大肠杆菌trpC突变的能力来筛选文库中的质粒。

(2)通过电穿孔的方法在感受态大肠杆菌DH5a或菌KC8(pyrFleuB600trpChisB463)中引入1~5ul的质粒DNA制备品，把细菌铺在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上，37°C孵育过夜。

(3)如果质粒DNA转入了，则进行步骤4,如果质粒DNA转入了KC8中，则：

a.在LB/氨苄青霉素平板上重新划线培养，或复制平板将菌落转移至细菌用基础培养基（色氨酸缺乏)，37°CC孵育细菌过夜。
在这些条件下生长的菌落含有PJG4-5文库质粒，此质粒携带的TRP1基因有效地补足了细菌trpC9830突变。
转化混合物一开始铺在LB/氨苄青霉素平板上比直接铺在细菌用基础平板上的生存压力要小，增加了所得的菌落数，

b.从一个分离的菌落制备小量的DNA，按步骤2所述利用这些DNA转化细菌DH5a细胞。
KC8DNA的小量制备可用于酵母的限制性酶切、PCR和重新转化。然而，我们建议在打算测序之前，使用KC8的小量制备DNA来转化更加容易接受的大肠杆菌株，如DH5a。KC8制备的DNA通常不适合用来进行双脱氧或自动测序，即使在充分的纯化之后情况也是一样。

(4)从携带文库质粒的DH5a细胞制备小量的DNA。
要点：一般来说，从原始的阳性相互作用子产生的两个或三个单独的细菌菌落制备DNA是一个很好的主意。相对于细菌来说，酵母能够耐受重复多次的带有相同选择标志的2u庾粒。如果一个单个酵母细胞含有两个或三个不同的文库质粒，其中只有一个质粒编码了相互作用蛋白质，相关的cDNA克隆在质粒的分离阶段就可能丢失。再者，一般来说，这不是主要问题，平均大概10%的酵母细胞将含有两个或更多的文库质粒。

(5)通过对含有相同插入片段的阳性克隆制备的重复样品来进行限制性酶切分析确证和/或确定是否重复分离到了小量的cDNAs。
携带EcoRⅠ+I的文库质粒分解时将释放cDNA的插入片段，而携带有EcoRI+XhoⅠ+HaeⅢ的文库质粒分解时将“指示”不要绝望。全部阳性菌落中只有少量的生长时，或相互作用子cDNA在文库中的丰度很低时，真正的相互作用子已经作为单一的阳性克隆被得到。
重要：一些研究人员在这个时候会对DNAs进行测序。大量的钱可能浪费在了非特异性相互作用子的测序上，我们强烈建议测序之前应该完成下面所述的酵母转化和特异性检测。

阳性相互作用的第二次确证：重复表型和特异性检测

相互作用蛋白特异性的最终检测是把来自大肠杆菌的文库质粒重新转化到含有“处女型”lexAop-LEU2/lexAop-lacZ/pBait的菌株中其目的是验证是否依然可以观察到依赖相互作用的表型和依然对原来的pBait存在特异性。这次验证将消除假阳性，包括在半乳糖培养基生长或活化转录的原始转化酵母EGY48中的突变、与lexADNA结合域相互作用的文库编码cDNAs以及"黏稠的"并与多个pBait混合相互作用的文库编码蛋白。

(6)用下面的几组质粒转化酵母株EGY48,在CM(Glu)-Ura-His平板上筛选菌落。

a.pMW112和pBait

b.pMW112和pRFHM-1

c.pMW112和一个非特异性诱饵蛋白
如果筛选中最初使用的pBeil能够激活转录，即使很轻微，我们强烈地推荐对照诱饵也应该是能微弱地活化转录的非特异性对照诱饵。一般来说，微弱地激活转录的诱饵很难与假阳性的背景相区分。一些假阳性也通常与微弭活化的LexA融合蛋白发生相互作用。

(7）2~3d后就可以使用由步骤6所得的转化酵母。使用电穿孔的方法把得自大肠杆菌KC8和DH5a的质粒引入单个的转化子a~c中。把转化混合物铺在CM(Glu)-Ura-His-Trp平板上，30°C孵育平板直至菌落长出（2~3d)。
重要：阴性对照也可以作为带有pJG4-5文库载体转化子a~c的电穿孔样品。

(8)为每个需要检测的文库质粒制作一块CM(Glu)-Ura-His-Trp主板。通常情况下，最接近的文库质粒转化子a~c在平板上划线培养有助于简化非特异性相互作用单元的检测。
重要：毎一个平板也应该包含转化了pJG4-5阴性对照的a~c系列。

(9)正像第二阶段步骤21所描述的那样，检测β-半乳糖苷酶活性和亮氨酸营养缺陷型。

(10)分析这些特异性检测的结果，并对所得阳性分离物进行测序（请参见第4章方案13)。