膜体系酵母双杂交文库介绍

酵母双杂交（Yeasttwohybrid）技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域，已成为分子生物学研究领域的重要实验手段。经过不断的完善和发展，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的在于还可发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白。传统的酵母双杂交系统仅限于核蛋白的互作分析，不能进行膜蛋白的研究。DUALmembrane系统(DUALmembranesystem)是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统，它提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法，使得分析膜蛋白间的互作成为现实。其主要特点是可以进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究。它既可以用于表达文库的筛选，也可以应用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的验证。

DUALmembrane膜体系酵母双杂交文库系统

基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统，区别于传统的核蛋白互作分析，可用于研究膜蛋白间及膜蛋白与胞质蛋白间的互作。在酵母细胞中，泛素可以分成两部分表达，即其N端部分(NubI)和C端部分(Cub)，后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白([NubI:Cub]-reporter)体系。

DUALmembrane膜体系酵母双杂交文库系统特点

●任何一种膜蛋白都可以作为诱饵

●在细胞膜上原位检测蛋白-蛋白间的相互作用而无需核定位信号

●使用分离的泛素结构域(NubG/Cub)使得相互作用蛋白质之间的空间位阻最小化

●蛋白间的互作信号依赖泛素特异性结合蛋白(UBPs)剪切人工转录因子(LexA)启动，而不是靠转录，因此可以检测蛋白自身的转录激活或抑制序列

欧易特色

●十二年文库技术积淀，具有丰富的样品处理经验和建库经验 

●国内独家提供膜体系酵母双杂交文库服务 

●可构建普通酵母双杂交文库和均一化酵母双杂交文库 

●快速、高效地获得高质量的膜体系酵母双杂交文库

膜体系酵母双杂交文库项目流程

提供内容

●实验报告：详细实验流程、各阶段电泳图、文库库容量、插入片段长度鉴定图等

●文库质粒100μg以上

膜体系酵母双杂交文库样品要求

●RNA：≥1μg，OD260/280为1.8-2.2

●文库质粒100μg以上

常见问题

需要老师对目标诱饵基因有详细的了解，如果诱饵基因是定位在膜上的蛋白则选择膜体系文库，如果诱饵基因是定位于核则选择核体系文库，如果诱饵基因有跨膜区也可以考虑把跨膜区切除以后用核体系文库筛库，但是这样操作有一定风险。

库容（每毫升文库菌液库容量）的计算公式：CFU/ml=平板上的克隆数/平板上涂布菌液的体积μl×n×1000μl。所代表意义：（1）n是原始菌液的稀释倍数；（2）克隆数除以涂布的体积所得数据是每微升稀释菌液所含阳性克隆数；（3）每微升稀释菌液所含阳性克隆数乘以稀释倍数所得数据是每微升原始菌液所含的阳性克隆数；（4）最后乘以1000μl，就是1ml原始菌液所含的阳性克隆总数，即每毫升文库菌液的库容量（CFU/ml）。那么总的文库库容（CFU）=CFU/ml×文库菌液的总体积（ml）。插入片段平均长度：随机挑取24个菌落PCR所得到的插入片段长度的总和的平均值。重组率：根据菌落PCR中所有阳性插入片段的克隆在总检测克隆数中所占比例。

老师拿到文库后可对文库进行质检以判断文库质量，欧易会提供一个质检流程，老师只要按照流程操作即可。文库质量的关键指标是库容、重组率及插入片段平均长度。库容并不是越高越好，欧易承诺的库容一般>106，一般物种的转录组为104，因此文库覆盖转录组100倍以上对于筛库已足够；此外，库容过高只会增加文库的冗余率。酵母双杂文库的插入片段平均长度也不是越长越好，该实验的最终目的是筛到相互作用蛋白，只要基因的结合区域存在就可能被筛到，并不需要全长基因。如果只追求片段长度可能会损失掉很多较短的相互作用蛋白。

膜体系文库只有共转一种筛库方法。

案例展示

案例一：DUALmembrane系统——灰飞虱CPR1结合RSV来介导水稻条纹叶枯病毒传播

研究背景：

植物病毒病依赖于媒介昆虫传播,而媒介昆虫对植物病毒的传播是一个昆虫、病毒、寄主植物互作的过程，历经获毒、持毒和传毒等多个阶段，昆虫体内一系列病毒受体或蛋白参与了这个过程。水稻条纹叶枯病毒（RSV）引起的水稻条纹叶枯病对水稻生产造成严重的危害。RSV由灰飞虱传播，病毒可在灰飞虱体内生存，繁殖并能经过昆虫卵传播至后代昆虫体内，但具体传播机制并不清楚。

研究内容：

本研究利用酵母双杂交、免疫荧光和RNA干扰等技术手段分析RSV的传播机制。研究表明：灰飞虱CPR1可通过结合RSV来介导水稻条纹叶枯病毒的传播。

CPR1和CPR1N片段与RSVpc3互作

研究结果：

●1.RT-PCR在灰飞虱中鉴定RSV，RSV阳性的灰飞虱用于膜体系酵母双杂交文库构建。将CDNA文库克隆至pPR3-N上，提取质粒并转染DH10B菌株。结果表明：文库库容为1.2×106cfu/19.5μl，插入片段平均长度为1.5kb。

●2.构建诱饵重组载体pDHB1-RSVpc3并转染酵母NMY51。随后将cDNA文库和诱饵载体pDHB1-RSVpc3共转酵母NMY51进行筛选。筛选到的阳性克隆进行测序及分析。该研究中共筛选到66个互作蛋白，进一步的酵母双杂交实验结果表明：CPR1和CPR1N片段可与RSVpc3互作。

●3.ChemiluminescentCo-IPAssay、免疫荧光和RNA干扰等实验结果表明：灰飞虱CPR1可通过结合RSV来介导水稻条纹
叶枯病毒的传播。

案例二：拟南芥纤维素合成相关蛋白质互作研究

研究背景：

在高等植物中，纤维素由作为催化亚基的纤维素合成酶(CESAs)蛋白复合体合成。在拟南芥中，三个蛋白（CESA1、CESA3、CESA6）与初生细胞壁有关，三个蛋白（CESA4、CESA7、CESA8）与次生细胞壁有关。

研究内容：

本研究采用酵母双杂交系统和分子生物荧光系统对拟南芥中三个初生纤维素合成酶（CESA1、CESA3、CESA6）和三个次生纤维素合成酶（CESA4、CESA7、CESA8）进行了研究。结果表明：初生CESAs与次生CESAs复合体在拟南芥的某个特定时期发挥作用。

初生CESAs与次生CESAs互作

研究结果：

●1.PCR扩增得到拟南芥AtCESA1、AtCESA3、AtCESA6、AtCESA4、AtCESA7、AtCESA8的cDNA全长，并分别将其克隆至pTFB1vector（bait）和pADSL-Nxvector（prey）上。随后采用酵母双杂交分析初生CESAs与次生CESAs之间的相互作用。酵母双杂交及BiFC结果表明：初生CESAs（CESA1、CESA3、CESA6）和次生CESAs（CESA4、CESA7、CESA8）之间存在相互作用。

●2.转基因株系分析、纤维素测定、木质部染色分析、共聚焦显微镜分析等结果表明：初生CESAs与次生CESAs复合体在拟南芥的某个特定时期发挥作用。

参考文献

[1]LiuW,GrayS,HuoY,etal.ProteomicAnalysisofInteractionbetweenaPlantVirusandItsVectorInsectReveals NewFunctionsofHemipteranCuticularProtein.MolCellProteomics.14,2229-2242(2015).(IF:5.912)

[2]CarrollA,MansooriN,LiS,etal.ComplexeswithmixedprimaryandsecondarycellulosesynthasesarefunctionalinArABIdopsisplants.Plantphysiology,2012;160(2):726-737.


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