酵母双杂交实验常见问题分析及处理方法

在某些情况下，国产ELISA试剂盒在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1ml的SD/–Trp，接着将重悬液平铺于5个100-mm的SD/–Trp平板，在30℃下温浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml0.5XYPDA刮下每块板上的克隆，并收集到一管中，这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。

如果诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达，该如何处理?

该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。可以通过基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活，但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。

转化效率太低怎么办?

可以采用以下方法解决：

1)国产ELISA试剂盒检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。

2)DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。

3)不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。

4)检测pGBT9对照载体的转化效率，放置于SD/–Trp平板上，转化效率应该在1x105colonies/mgDNA以上。

杂交效率不高，该如何处理?

在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的、新鲜的克隆进行培养，经过离心和重悬后，再使用血球计对细胞进行计数。密度应该在1x109/ml。

一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性，同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。国产ELISA试剂盒也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。