服务报价：3万元整，目前9折促销，即2.7万元整。免费赠送3个读码框处理，以确保蛋白可以正常表达。

可以选择增加提供转化到酵母的文库，可以提供足够100次筛选的酵母转化菌液文库，同时还会提供质粒文库。

限时促销，赠送均一化处理，可以有效提高低丰度基因筛选检出率。（样本内天然存在的基因，表达丰度差异是很大的，可以相差上千倍以上，任何文库构建方法也是需要做均一化处理的，不像有的公司由于不能做均一化处理，而宣传不需要做均一化）。

服务时间：25个工作日内 

     传统的酵母双杂交的局限性：

    ◆只能检测发生在核内的蛋白质间相互作用；无法检测胞膜蛋白质间相互作用；

    ◆不少蛋白质需在内质网或细胞质中经过转录后修饰，才能与其他蛋白质发生相互作用，传统的酵母双杂交无法检测；

    ◆有些蛋白质本身就是转录激活因子，可以对报告基因的表达进行调控；传统的酵母双杂交也无法检测。

    我们采用DUALmembrane膜蛋白酵母双杂交系统，DUALmembrane 技术突破了传统酵母双杂交的局限，扩大了酵母双杂交的应用范围。DUALmembrane技术在传统的酵母双杂交系统的基础上，巧妙地利用分离的泛素系统（split-ubiquitin）进行蛋白质相互作用的筛选。

    我们拥有多年的文库构建经验，已完成数千个各类文库构建，所采用的技术以及试剂盒均为市场上质量最好的文库构建试剂，保证所构建的每一个文库各项指标均为市场上最高标准，我们构建文库的成功率为98%以上。关于我们的文库构建产品，我们承诺的指标如下，各项指标在国内各家公司里是最高的。
     上海海科结合多年的文库构建经验，强势推出“All-Direct”文库构建技术，我们的产品较其他构建方法（主要有takara的SAMRT方法和invitrogen的gateway方法），技术和质量上都具有极大的优势。

一、产品质量标准与报价:：:
   关于我们的文库构建产品，我们承诺的指标如下，各项指标在国内各家公司里是最高的: 

原始文库库容量大于1*10^7CFU；
平均插入片段大于1200bp ；
克隆阳性率大于95%。
报价：人民币3万元整。

 
二、技术特点与技术优势:

    1.我们是采用同源重组的方法构建文库，没有经过任何的内切酶切割和连接过程，确保不会出现基因被酶切切断的情况，能够保证基因的完整性，而Clonetech的是用酶切连接的方式构建的。 

    2.由于我们采用的是重组的方式把cDNA重组到载体上，相对clonetech的SMART的T4连接酶的方法效率要高的多，我们承诺原始库的库容量在1*10^7以上。而且重组的方式假阳性很低，我们这里有的客户一次测3万个克隆，都没有出现一个空载的情况，我们承诺阳性率大于98%，这是酶切连接的方法远远无法比拟的。 

    3.Clonetech的SMART方法是用PCR的方法合成第二链的，由于PCR的选择性抑制及竞争性扩增，这样就会造成基因冗余度非常高，低丰度的基因PCR扩增不到，会丢失掉，长片段的基因也会丢失掉，另外会造成重复序列非常多，特别是起始的RNA样本量少的情况（比如5ugRNA以下就需要进行15个循环以上的PCR扩增，大大降低文库质量),，大大降低文库包含的基因数量，而我们的cDNA合成方法是用多种酶在16度恒温的条件下直接合成第二链的，这样就完全忠于样本自身的基因情况，不会人为的改变样本内的基因情况以及基因大小，大大提到文库的质量。 

    4.我们是采用的一种高质量的反转录酶，该反转录酶是公认的最好的反转录酶，较clonetech的反转录酶具有反转录温度高（55摄氏度反转，clonetech的反转录酶是使用42度反转，较高的温度可以打开RNA的二级结构，可以获得更长的cDNA），反转录效率和cDNA长度要好的多。我们承诺文库的平均插入片段在1.3Kbp以上，最低长度也在1Kbp以上，而clonetech的SMART方法构建出来的文库一般只有几百BP。

文库构建流程: 
1.RNA提取 
2.mRNA提取 
3.cDNA的酶促法合成
4.cDNA连接接头 
5.cDNA按长度分离 
6.cDNA与膜蛋白酵母双杂交文库载体(pPR3-)进行all-direct重组 
7.重组产物电转化 
8.文库检测以及质粒提取
 
三、技术详细比较:

1．与Clonetech(Takara)的SAMRT方法技术比较：
 

2.与invitrogen的构建方法比较
 

四、交付结果：
    我们的酵母双杂交文库可以自由选择使用pGADT7（Clonetech,推荐）或者pDEST22（invitrogen）载体,交付的产品如下：

五、服务时间:
   25个工作日内，如需转化酵母延长15个工作日。
备注1：该酵母文库可以选择增加均一化处理步骤，我们使用DSN法均一化方法，可以构建出高质量的均一化酵母杂交文库，可以大大减少后续酵母筛选的工作量和筛选效率等。 

六、材料要求:
    客户构建指定的酵母双杂交cDNA文库，由客户提供组织、细胞或总RNA给我们即可：
 细胞样本：细胞数量大于1*10^7 
 动物样本：大于1g 
 植物样本：大于2g 
 总RNA：大于200ug 

七、客户案例:

    目前我们已经成功完成2000多个的文库构建，主要客户为中国科学院上海植物生理生态研究所、上海交通大学、浙江大学、浙江省农科院、山东省农科院等多家单位完成酵母双（单）杂交文库构建服务，物种包括人、小鼠、大鼠、水稻、拟南芥、牡丹、稻飞虱、苹果、油菜、小麦、贝壳、葡萄、真菌等。

八、文库筛选:
    我们是国内极少数能同时提供文库构建和文库筛选的公司，对于酵母双杂交筛选服务，您只需要提供诱饵基因序列即可，我们会进行以下工作，筛选的报价为3万元整:

1.诱饵载体的测序验证以及构建到双杂交筛选载体上
2.诱饵基因的自激活检测，检测通过后继续下一步实验。
3.诱饵质粒转化酵母细胞，验证合格后再转化文库质粒
4.酵母筛选和3AT条件优化
5.筛选结果的测序
6.筛选结果的回转验证
7.筛选结果递交:包括筛选报告，筛选结果的测序结果和blast结果，筛选结果克隆的质粒实物。

九、FAQ:

9.1. 如何选择合适的文库构建方法进行建库？

   我们是市场上唯一可以同时提供3种文库构建方法的公司，这也足以看出我们公司的技术实力。
3种方法的比较如下：

   1)Clonetech的SMART方法，该方法基本是被淘汰的，我们上文有详细的技术比较，其唯一的好处就是RNA的起始量可以很小，一般只需要几ug即可，该方法成本很低，一般不建议选择。

   2)Invitrogen的方法，该方法质量上较SMART方法要好很多，其对试剂的质量要求也很高，必须全部使用invitrogen的原厂试剂。我们全部使用invitrogen公司试剂进行构建，且做了一些技术改进，提高了文库质量。该方法对起始的RNA要求较高，建议起始用量是大于200ug。但该方法有一个严重的缺点，就是需要进行两次重组才能得到酵母文库，而多一次重组就会多一次文库扩增过程，会严重影响文库质量。在上文中有详细的技术比较和介绍。
    别的使用该方法建库的公司，只能完全使用商业化的试剂盒构建文库，没有做任何改进。且由于进货渠道的原因，试剂盒内的有些试剂他们是买不到的，质量就会大打折扣。比如DH10B电转化感受态细胞，这个感受态细胞转化效率比国产的高出100倍以上。这个感受态细胞需要具有一堆的海关批文才能买到，其他公司由于没有相关资质，是无法进口的，据我们了解，国内某公司居然会用化学转化细胞代替电转化，质量影响巨大。

    3)All-Direct专利方法，这个是我们的独家专利方法，是在invitrogen方法上做了重要改进，保留了其优点（不用PCR扩增，文库保真度高），去除了其需要经过两次重组的缺点，大大提高文库质量。平均长度较invitrogen方法可以提高200bp，库容量可以提高10倍以上。该方法对RNA的要求量和invitrogen方法一样。

9.2. 海科生物提供的酵母双杂文库有哪些产品内容？

    我们提供的文库产品，包含了文库质量（大于200ug）以及大肠杆菌文库甘油菌。同时可以选择提供转化到酵母细胞的文库甘油菌，我们会提供100只转化到酵母细胞的文库甘油菌，可以做100次的文库筛选。
    其中文库质粒可以使用共转的方法进行文库筛选，酵母细胞文库甘油菌可以使用maiting的方法进行文库筛选，根据老师的实验习惯可以自由选择，结果没有任何差异的。

9.3. 如何检测文库质量？

    对于文库的质量，一个简单的金标准就是，样本内的所有基因都在文库里，且基因要有一半以上的全长基因，这个文库就是合格的。
    对于文库的检测，可以针对我们交付的产品，做以下几个方面的检测：
    根据老师的样本信息，选择3-5个低拷贝的基因，设计合成引物，以我们提供的文库质粒为模板，进行PCR扩增，如果低拷贝的基因都能扩增出来，高拷贝的就不会丢失，文库质量即可以判断为合格。
    对于我们提供的大肠杆菌文库甘油菌，可以进行梯度稀释后铺板培养，第二天计算库容量，同时挑取单克隆进行PCR扩增和测序检测，以判断插入片段长度和空载率。

9.4. 如何评价文库质量？

     文库质量的关键指标，主要是文库库容、空载率及插入片段平均长度。
    文库的原始库容肯定是越高越好，我们公司承诺的是大于1*10^7的库容量，这个是原始库容量，也就是没有经过任何扩增过程，直接转化出来的库容量。比其他公司承诺的1*10^6的库容量要高10倍以上，下面详细解释下库容量的高低对文库质量的影响:
    生物样本，除了低等生物，目前研究比较多的物种，比如人，大鼠，小鼠，其基因数在5*10^4左右，文库至少得100倍覆盖，也就是库容至少需要5*10^6以上。
    对于植物样本，其基因数量比人的大很多，比如水稻样本，其基因数量为人的2-3倍，小麦样本，其基因数量为人的5-6倍，这样就需要更多的文库库容量。对于水稻样本，需要覆盖100倍的基因数，要求的文库原始库容量是大于1*10^7以上。市场上别的公司提供的文库最多只能覆盖10倍左右，这么低的覆盖度，必然造成大量基因的丢失。
    对于有的公司宣传的，库容量不是越高越好，这绝对是不负责任的忽悠，为自己的文库质量不合格找不合理的借口。
    对于插入基因长度，别的公司一般平均长度就在800bp左右，我们公司可以承诺做到1200bp以上，这个差距是巨大的，下面再   详细介绍下插入片段长度对文库质量的影响：
   一般的一个功能基因，其一般长度会在200个氨基酸以上，也就是编码区在600bp碱基以上，装入文库的基因，除了编码区，还会有5’UTR区，3‘UTR区以及polyA区域，这几个部分加起来，基因的长度一般至少会在1000bp以上。由于文库是个混合物，会存在竞争性抑制，短的基因过多，势必会影响长度基因的比例，以及长的基因的表达丰度。
    我们的文库产品，插入片段平均长度会在1200bp以上，最短的会在1000bp左右。对于文库筛选，不是说只要有基因的一个片段就可以了，蛋白质的功能需要多种因素的参与，如果插入基因过短，筛选到的结果只是一个基因片段，甚至是靠近polyA的一小段基因，这个结果的可行度在哪里？基本都可以认为是假阳性的结果的。
    对于有些公司宣称的，文库的基因插入片段不是越长越好，其实是对客户的极其不负责任和不合理的忽悠，只是因为自己没有技术做到更长的片段长度，而找的理由。

十、客户文章示例

核蛋白酵母双杂交文库客户文章示例：

【1】Yeast-2-Hybriddatafileshowingprogranulininteractionsinhumanfetalbrainandbonemarrowlibraries[J],atainBrief,Volume9,December2016,Pages1060-1062

【2】ZhenhaiYu,YingyingGe,LeiXie,etal.Usingayeasttwo-hybridsystemtoidentifyFTCDasanewregulatorforHIF-1αinHepG2cells[J],CellularSignalling,Volume26,Issue7,July2014,Pages1560-1566

【3】ZhanyangYu,1NingLiu,1YiWang,2XiaokunLi,etal.IdentificationofNeuroglobin-interactingProteinsUsingYeastTwo-hybridScreening.Neuroscience.2012Jan3;200:99–105.

【4】CuiLG,ShanJX,ShiM,etal.DCA1ActsasaTranscriptionalCo-activatorofDSTandContributestoDroughtand SaltToleranceinRice.PLoSGenet.11,e1005617(2015).

【5】JingNing,BaocaiZhang,NiliWang,IncreasedLeafAngle1,aRaf-LikeMAPKKKThatInteractswithaNuclearProteinFamily,RegulatesMechanicalTissueFormationintheLaminaJointofRice.ThePlantCell,Vol.23:4334–4347,December2011.

【6】RakshaSingh,Mi-OkLee,Jae-EunLee,JihyunChoi,RiceMitogen-ActivatedProteinKinaseInteractomeAnalysisUsingtheYeastTwo-HybridSystem.PlantPhysiology,September2012.Vol.160,

【7】X.F.Zha，M.Zhao，C.Y.Zhou,H.Z.Guo.AnalysisofinteractionbetweenBmhrp28andBmPSIinsex-specificsplicingofBombyxmoriBmdsxgene.GeneticsandMolecularResearch13(3):5452-5462(2014)

【8】ChaoZhang,RongchaoGe,JunwenZhang,IdentificationandExpressionAnalysisofaNovelHbCIPK2-InteractingFerredoxinfromHalophyteH.brevisubulatum.PLOS.December4,2015.

酵母单杂交文库客户文章示例：

【1】NobutakaMitsuda,MihoIkeda,ShinobuTakada,etal.EfficientYeastOne-/Two-HybridScreeningUsingaLibraryComposedOnlyofTranscriptionFactorsinArabidopsisthaliana.PlantCellPhysiol(2010)51(12):2145-2151.

【2】Chang-QingYang1,XinFang1,Xiu-MingWu1,etal.TranscriptionalRegulationofPlantSecondaryMetabolism.JournalofIntegrativePlantBiology2012,54(10):703–712

【3】ZejunHuang,ZhijinZhang,XiulingZhang,etal.TomatoTERF1modulatesethyleneresponseandenhancesosmoticstresstolerancebyactivatingexpressionofdownstreamgenes.FEBSLetters.Volume573,Issues1–3,27August2004,Pages110-116

膜蛋白双杂交文库客户文章示例：

【1】YasuyukiNakamura,JunIshii,AkihikoKondo.Rapid,FacileDetectionofHeterodimerPartnersforTargetHumanG-Protein-CoupledReceptorsUsingaModifiedSplit-UbiquitinMembraneYeastTwo-HybridSystem.PLOSone.June2013,Volume8,Issue6.

【2】ZheMa,HuiZhang,JunxiZheng.InteractionbetweenM-LikeProteinandMacrophageThioredoxinFacilitatesAntiphagocytosisforStreptococcusequissp.Zooepidemicus.PLOSone.February2012,Volume7,Issue2.

【3】PratimaPandeyandSinghHarbinder.TheCaenorhabditiselegansD2-likedopaminereceptorDOP-2physicallyinteractswithGPA-14,aGαisubunit.PandeyandHarbinderJournalofMolecularSignaling2012.

 中文论文（写了公司名称）：

【1】张云云，周君，李晔.可口革囊星虫(Phascolosomaesculenta)酵母双杂交文库和铁结合蛋白真核表达载体的构建.海洋与湖沼,44卷，第6期。

【2】欧阳沫，唐潇，黄惜，袁红梅。巴西橡胶树ＨｂＩＣＥ１基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选。植物科学学报，2016，34(2):255~262.

【3】岳珊珊，夏来新。酵母双杂交筛选与果蝇C(2)M相互作用的蛋白。遗传，2015.11,37(11)

【4】专利：一种结合串联重复序列（TTTACAC）5的Dof蛋白质