1主要试剂

STRPvimer                      PostiveControlDNA

STRBuffer                      AlleleLadder

GoldTaqDNAPolymerase         Rox-350

2主要仪器

DNA扩增仪（PE9700）

自动测序仪（PE377）

微型高速离心机

GeneScan软件

Geneotyper软化

3操作步骤

3.1基因组DNA提取——盐析法

3.1.1操作流程

用方框图形式，按照GeneScan技术的先后顺序和技术要求、分割形成7个相对独立的实验阶段，以便合理安排分配试验时间，提高工作效经。

3.1.2操作步骤：

   ①取0.1ml血样置于1.5mlEP管。

②加500μlTE缓冲液，充分混匀静置5分钟。

③13000rpm离心2分钟，用无菌移液管移弃上清液。

④加TE缓冲液重复②、③步一遍，然后用红细胞裂解缓冲液（RCLB），重复②、③步两遍。

⑤最后一次RCLB洗涤后，移去上清液，加入100μlDSP工作液，充分混匀直至沉淀块碎。

⑥56℃孵育2小时。

⑦95℃孵育10分钟。

3.1.3纯化DNA

   ①加35μl高氯酸钠，混匀后13000rpm离心5分钟，小心吸取上清液。

②加2.5倍体积冷无水乙醇，沉淀DNA，12000rpm离心8分钟，弃上清液。

③加入1ml70%乙醇洗涤DNA，10000rpm离心7分钟，弃上清液。

④置超净台内自然干燥后，加入100μlddH₂O，置4℃保存，待用。

提取基因组DNA                                  纯化DNA

（盐析法）                                    

       DNA定量

         扩增

         电泳

GeneScan

Genotyper

计算机分析处理

                     操作流程图

3.2DNA定量

3.2.1配制0.8%琼酯糖凝胶

3.2.2将标准含量（20ng/μl、10ng/μl、5ng/μl）的DNA样品和分子量大小DNA参照物置于干热器孵育5分钟，稍离心。

3.2.3将分子量大小DNA参照物、标准量DNA及待测DNA样本各10μl依次加入胶中。

3.2.4电压150V、电泳30分钟。

3.2.5将胶置于紫外透测仪上，观察结果并照像。

3.2.6与标准量DNA比对，估算并记录样本DNA含量。

3.3基因扩增

反应体系为10μl，其中样本DNA4.0μl，MasterMix6.0μl。

3.3.1根据定量结果将模板DNA量全部调至1ng/μl。

3.3.2配制扩增反应液（MasterMix），（注：在冰上操作）。

STR10×Buffer                    4.58μl

STR10×Primer                    2.08μl

TaqDNApolymerase(5μ/μl)          0.17μl

以上反应物混合后用8联枪，加至每个样品扩增管中（在冰浴上操作）。

3.3.3将模板DNA4.0μl和已对照DNA4.0μl分别加入已标记好的96孔薄壁扩增管内，混匀后加橡胶垫盖紧管口，置PE9700型扩增仪中。

3.3.4十个位点扩增热循环参数的设置：

最初预变性95℃11min；94℃，1min；59℃1min；72℃，1min共28个循环，最后60℃，延伸45min；4℃保存备用。

3.4电泳

采用美国PE公司制造的377A型自动测序仪进行。

3.4.1预电泳条件：时间20min，功率50W，电流13mA，电压1KV。

3.4.2FLS/G350混合液的配制。

FLS                3.6μl

Rox-350            0.4μl

以上反应液混合后，用8联枪分置在48孔扩增管中。

3.4.3DNA样本处理：将扩增产物用去离子水对倍稀释后取3μl，分别加入标记好有FLS/GS350混合液4μl的扩增管中并混匀。在第1孔和第48孔加入1μlSTR等位基因标记物；第2孔和第47孔为已知对照DNA，第3～46孔为样本DNA，操作全过程均在冰浴上进行；混合物置PE9700扩增仪上进行95℃，5min变性，然后放置冰浴中备用。

3.4.4电泳：按照扩增板上各样本的排列顺序，用8道加样器吸取样本0.8μl加至上样槽中，在第1和48泳道中为Ladder，第2和47泳道为P·C，第3～46泳道为样本DNA。

电泳条件：时间2小时30分钟，功率200W，电流强度60mA，电压30KV。

3.5基因扫描

用GeneScan软件将电泳收集的电泳图谱信息经过电子计算机处理成数据信息。

3.6基因分型

用Genotyper软件，依据数据信息与设计等位基因分子大小标记的内标比较被定义。以美国PE公司的等位基因标准物（AlleleLadder,AL）为参照物进行分型，等位基因按重复次数命名，电泳图谱中不同位点的等位基因显示出不同颜色，同一位点的不同等位基因为同一种颜色，它们的迁移率各不相同。电泳图谱中的颜色分为红、黄、蓝、绿。红色为Genescan-350[ROX]，是设计的等位基因分子量大小标记物，在变性条件下产生的片段大小：50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350bp；黄色为NED，标记的基因位点有D5S818，D13S317和D7S820；蓝色为S-FAM，标记的基因位点有D3S1358，VWA和FGA；绿色为JOE，标记的基因位点有Amelogenin,TH01,TOPXtCAF1PO。