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成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调,但未成功转染的细胞却不受影响,这时转染效率和总的细胞数量就很重要,一般细胞数量较少时转染效率高,一些试剂由于本身毒性的影响,太低的细胞数量时毒性明显,所以会要求较高的细胞密度(汇合度),顺便说一句,看一个转染试剂的毒性,看它要求转染时的细胞密度就知道了。siRNA的转染和DNA的转染不一样,DNA的转染是过量表达,死亡一些细胞对过量表达的蛋白本身来说影响不大,但siRNA的转染,死亡的细胞所有的基因表达(包括特定目标基因)都下降,将与siRNA造成的特定目标基因的表达下降现象是一致的,将大大影响实验结果。选用低细胞毒性的转染试剂其实很重要,比如engreen的Entranster-R4000.
由于siRNA沉默时效性的影响,转染后48小时才能进行进行qRT-PCR检测,转染后48-72小时才能进行蛋白检测。如果转染时铺板密度较高,细胞一方面转染效果不理想,直接影响沉默效果和数据可靠性,另一方面,48小时甚至更长时间后,沉默检测最佳点时,过于密集的细胞将影响细胞状态,从而影响实验结果。
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回复:时间:2021-08-07
转染后28-48小时才能进行进行qRT-PCR检测,转染后48-72小时才能进行蛋白检测。实验时最好要设置好阳性对照,FAM标记的荧光对照可以观察转染效率,GAPDH等阳性对照组可排除实验操作的影响的,如果没有验证有效的靶序列,最好多设计几条,我是买的Transheep 的4+3 siRNA 套装,筛选后有2个靶点有效,之前做一个target的时候审稿人会问脱靶的问题,2个target同时做,啥也不说了,转染效率也很重要,如果转染效率是70,靶点的干扰效率就算有80,最后体现的实际效率只有56,siRNA转染需要用专门的转染试剂,lipo2000做实验效果不是很好,毒性大,如果遇到难转的细胞,效率也很低,现在有纳米材料的转染试剂非常好用,比如我购买Transheep 他们赠送的 Namipo,纳米泡转染试剂,相对于之前用的好太多,细胞生长的状态完全没有收到转染的影响,几乎没飘什么细胞,上个我转染的效果图,这个是用纳米泡转染的siRNA-fam,细胞是RAW264.7
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