要用AnnexinV双染法测凋亡，又想同时标记蛋白Marker，甚至还有胞内指标，可是PI和7-AAD都不能洗，怎么办？

eBioscience的可固定细胞活力染料FixableViABIlityDye帮您完美解决

固定、破膜以及洗涤步骤不影响FixableViabilityDye的染色，而PI、7-AAD的染色通常是放在其他抗体孵育完成后进行，不能洗涤即要上机检测；对于胞内抗体的染色，由于经过了固定步骤，经过PI或7-AAD染色后所有的细胞都是阳性，所以他们只适合于胞膜染色的死活细胞鉴定。

试剂

◎AnnexinVApoptosisDetectionkit(Cat.No.88-8007,88-8006,88-8005,88-8102,or88-8008)

◎10XBindingbuffer

◎AnnexinconjugatedtoAPC,eFluor450,FITC,PEorPerCP-eFluor710

◎FixableViabilityDyeeFluor®660(Cat.No.65-0864),FixableViabilityDyeeFluor®506(Cat.No.65-0866)orFixableViabilityDyeeFluor®780(Cat.No.65-0865)

注意:FixableViabilityDyeeFluor®450不推荐与AnnexinV检测试剂盒同时使用

◎Foxp3StainingBufferSet(Cat.No.00-5523)

◎FlowCytometryStainingBuffer(Cat.No.00-4222)

◎PBS(azide-andserum/protein-freePBS)

实验方法

1.用蒸馏水稀释10XBindingBuffer至1X；

2.标记表面marker；

3.用不含叠氮钠及血清的PBS洗细胞两次；

4.在不含叠氮钠及血清的PBS按1-10x106cells/mL的浓度重悬细胞；

5.每1mL细胞中加入1μLofFixableViabilityDye并立即涡旋混匀；

6.2-8°C避光孵育30分钟；

7.孵育完成后，务必用含蛋白的缓冲液，如FlowCytometryStainingBuffer洗两次细胞；

8.用1XBindingBuffer洗一次细胞；

9.在1XBindingBuffer中按1-5x106cells/mL浓度重悬细胞；

10.100μL细胞悬液中加入5μL荧光标记的AnnexinV；

11.室温避光孵育10-15分钟；

12.用1XBindingBuffer洗细胞一次；

13.固定破膜，用破膜缓冲液洗细胞；

注意:此时已经不需要保持缓冲液中的钙离子，因为AnnexinV已经结合到细胞表面了

14.进行胞内marker的标记；

15.完成后上机分析。

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FixableViabilityDye可固定的死活细胞鉴定染料eBoscience