2021-08-14载体构建/RNA干扰/过表达载体/microRNA/细胞生物学 等技术话题讨论

对于细胞这块，大家都不陌生，但对于做科研实验的战友们，经常会遇到诸多不太顺利的问题，又得不到很好的解决方案。请大家将日常工作中遇到的问题，都发上来，大家一起讨论，共同学习和提高。问题：细胞培养方案如何选择呢？培养的细胞如何能更稳定？ 小编回复：有时候细胞传代几次后，细胞的生长速度会突然降低，而在转染过程中对细胞的毒性就会突然增加。这种不稳定可能和细胞培养条件的变化，细胞基因组的改变，还有某些细胞个体的选择性增殖有关，我们建议使用低传代系数的细胞（<50次），以规避细胞系的不稳定性，防止细胞株的衰老和转化，维持转染实验的可重复性。我们建议冻存一些细胞以备不时之需。生物危害品：人类和灵长类动物材料，手术和解剖样品必须在II级实验室中进行处理。所有的材料和器械在使用后都必须用湿热灭菌或合适的溶液浸没消毒处理。

请问版主，我有如下两个问题，请帮我解答一下：因为我最近在做细胞实验，但对于培养基和血清以及培养条件等，拿捏不准。不知道如何选择？请给我详细解答一下吧。还有一个问题，细胞培养方案如何选择呢？如果让培养的细胞能更稳定？非常感谢！

上面那位朋友，您好！看来您应该是刚开始从事细胞培养这部分实验吧，细胞实验其实说起来也挺容易，但想养好它，还是需要花点功夫的。下面，我就将你所提出的几点问题，帮你解答一下吧。问题：培养基和血清以及培养条件等如何选择？如果让培养的细胞能更稳定？回复：培养基的选择：常用的基础培养基包括Eagleminimalessentialmedium（MEM），DuibeccosmodifiedEaglemediun（DMEM）,RPMI1640，这些培养基是氨基酸，葡萄糖，无机盐，维生素和其他营养成分的混合物。许多公司都提供不同培养基的干粉或水溶液出售。使用前通常在基础培养基中添加血清，L-谷氨酸（L-谷氨酰胺），抗生素，有时还有抗真菌药。这样的培养基被称为完全培养基。血清的成分至今尚未完全确定，但已知它含有促生长和促贴壁的因子。不同的血清在促进某种特定细胞的生长方面可能会有很大的差别。胎牛血清（FCS或称FBS）是最常用的血清，但在某些场合也可以使用更便宜一些的小牛血清（NCS）或马血清（HS）。应对不同批次的血清测试以找到培养某种细胞所需要的最佳批次的血清。L-谷氨酸是一种不稳定的氨基酸，在溶液中会慢慢变成细胞不能利用的形式，应当在使用前加入。抗生素和抗真菌药物可以作为无菌操作技术的补充以避免细胞污染。培养条件：细胞的培养条件相当重要。细胞培养箱应能够严格控制温度，CO2的浓度。大多数细胞培养在37℃,5%CO2饱和湿度的条件下。但有些细胞要求更低的温度或更低的CO2浓度。细胞培养用容器：容器的类型可以影响贴壁细胞的生长。已有商业化的无菌一次性使用的培养瓶和培养盘适合哺乳动物细胞的贴壁培养。有些原代细胞并不需要任何培养基添加剂来帮助细胞贴壁和增殖，而有的细胞却需要多种添加剂才能正常生长。常用的添加剂包括黏着分子如胶原和纤连蛋白，荷尔蒙如雌激素，和生长因子如表皮生长因子和神经生长因子。培养器皿的选择也很重要，可以选择商业化提供的一次性无菌培养器皿。问题：细胞培养方案如何选择呢？回复：有时候细胞传代几次后，细胞的生长速度会突然降低，而在转染过程中对细胞的毒性就会突然增加。这种不稳定可能和细胞培养条件的变化，细胞基因组的改变，还有某些细胞个体的选择性增殖有关，我们建议使用低传代系数的细胞（<50次），以规避细胞系的不稳定性，防止细胞株的衰老和转化，维持转染实验的可重复性。我们建议冻存一些细胞以备不时之需。生物危害品：人类和灵长类动物材料，手术和解剖样品必须在II级实验室中进行处理。所有的材料和器械在使用后都必须用湿热灭菌或合适的溶液浸没消毒处理。原始材料新鲜高质量的原始材料是原代细胞分离培养的关键。胚胎组织比成体组织更容易分散开，产生更多细胞，这些细胞增殖更快。组织的形态特征在实验前应详加观察并记录。实验方案选择用机械分离法和酶法能在更短时间得到大量的细胞，这些细胞比组织块培养法得到的细胞更能代表整个组织的情况。但也要注意尽量减少细胞暴露在蛋白酶作用下的时间，以保证细胞最大活力。细胞培养实验方案无论是培养基的准备，还是细胞的培养和传代，动物细胞的建系和维持均需要规范化的操作。应该定期检查细胞是否有污染，是否需要添加新鲜培养基或是否需要传代。以下所列的细胞培养实验方案出自这些文献：CultureofAnimalCells,AManualofBasicTechnique,CurrentProtocolsinMolecularBIOLOGy,Cells:ALabortoryManual。解答完毕，谢谢大家！本帖旨在让大家多学知识，解决日常遇到的各类问题。如有不妥之处，欢迎指正！

下面给大家普及一些关于质粒的相关知识。首先，什么是质粒呢？质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子。能稳定独立存在于染色体外，并传递到子代，现代基因工程技术中常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术的重要工具。质粒又是如何扩增的呢？它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如果离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。获取质粒后，先在感受态细胞（DH5a等）中经转化、摇菌，再用质粒抽提试剂盒抽提。质粒是如何提取的？从细菌中分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞内，共价闭环质粒主要以超螺旋形式存在。在提取质粒的过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其他形式和构象的质粒DNA，因此在琼脂糖凝胶电泳中可能会呈现多个条带。感受态细胞是什么？受体细胞（如E.coli）经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性增强，成为能容许外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。我们常用的为DH5a、TOP10、JM109、Stbl3等菌株。这次先分享这些内容吧，欢迎大家踊跃发言，补充，同时也欢迎各位积极发言，共同提高！