通过引入ZoxP转基因序列对基因组进行修饰

材料

试剂

电泳级琼脂糖

2X细胞冻存液（含40%DMEM、40%胎牛血清、20%DMSO)

50XDenhardt溶液

Ig聚蔗糖（Ficoll，AmershamBiosciences17-0300-50)

Ig聚乙燔卩比咕■酮（Sigma-AldrichPO930)

Ig牛血清白蛋白（Calbiochem126609)

溶解于IOOml高压灭菌的水中。

硫酸葡聚糖（10%;Sigma-AldrichD7037)

二甲基亚砜（DMSO;Sigma-AldrichD2650)

用于基因转移的DNA目的克隆：一般是20kb左右的同源基因组片段。

DMEM培养基（GIBCO/Invitrogen11960-044)

胚胎干细胞（ES)

学术和商业机构可以提供很多鼠ES细胞系，像Rl种系（NagyetaL1993)，不需要饲养细胞，当白血病抑制因子存在时，可以直接在凝胶化的培养皿中生长。

ES细胞培养基

500mlDMEM

15%胎牛血清（94ml储存液）

0.lmmol/L非必需氨基酸（6.2ml储存液）

lmmol/L丙酮酸钠（6.2ml储存液）

55umol/L2-巯基乙醇（620/J储存液）

青霉素：链霉素：谷氨酰胺的混合液比例为l〇〇U+/ml:lOOU/ml:2mmol/L(6.2ml储存液）

lOOOU/mlLIF(ESGRO)(62一储存液）

乙醇（70%和100%)

胎牛血清（FBS;HycloneSH3OO7O.〇3)

G418(200mg/ml;GIBCO/Invitrogen11811-031)

凝胶（0.1%)

将〇.5g凝胶（TypeA，从猪皮中分离；Sgma-AldrichG2500)溶解于500ml组织培养级水中；高压灭菌。

杂交缓冲液

35%甲酰胺

4XSSC

25mmol/LNaH2PO4

10%硫酸葡聚糖

4XDenhardt溶液

100mg/ml娃鱼精子DNA

0.15XSET

杂交洗液

5ml20XSSC

IgSDS十二烷基肌氨酸钠

IL水

白血病抑制因子（UF;107U/ml)(ESGRO,ChemiconESG1107)

裂解缓冲液

lOumol/LTris-HCl(pH7.5)

10umol/LEDTA

10umol/LNaCl

0•5%十二規基肌氨酸钠

lmg/ml的蛋白酶K

MEM非必需氨基酸（10mmol/L;GIBCO/Invitrogen11140-050)

2-巯基乙醇（储存液为55mmol/L;GIBCO/Invitrogen21985-023)

矿物油』(Sigma-AldrichM8410)

NaCl-乙醇

将3ml5mol/L的NaCl溶解于100ml100%的乙醇。

NaH2PO4(lmol/L)

将I.7g二元磷酸盐（Sigma-AldrichS9390)和10.56g—元磷酸盐（J.T.Baker4011-01)溶解于IOOml水中。

寡核苷酸

基因特异性引物（必须从感兴趣的目的等位基因选择）

TK特异性引物（5‘-TTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCT03‘)

PCR试剂盒（TakaraExTaqpolymerase;TAKARA，TAKRR001)

青霉素：链霉素：谷氨酰胺的混合液（比例为10OOOU/ml:10OOOU/ml:200mmol/L)(GIBCO/Invitrogen10378-016)

磷酸盐缓冲液（PBS;GIBCO/Invitrogen14190-144)

质粒DNA

pfIox载体（Chuietal.1997)

ploxP2(用JV况I酶切得到含ZoxP位点的探针）（Omietal.1997)

用此方法也可以便利地构建其他质粒，只要酶切片段包含周围的基因组片段以及目标靶基因序列。这些质粒可用于检测同源重组前后以及Cre酶介导的重组后的等位基因结构。

预杂交缓冲液

6XSSC

20mmol/LNaH2P〇4

0.4%SDS

5XDenhart溶液

100ug/ml鲑鱼精子DNA

蛋白酶K(lmg/ml;Sigma-AldrichP6556)

鲑鱼精子DNA(Sigma-AldrichD1626)

IXSET

10mmol/LTris-HCl(pH7.5)

5mmol/LEDTA

1%SDS

丙爾酸钠（lOOmmol/L;GIBCO/Invitrogen11360-070)

20XSSC

将175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠<!>溶解于IL水中，调pH至7.0。

TE缓冲液

10mmol/LTris-HCl(pH7.5)

lmmol/LEDTA

胰酶-EDTA(0.05%;GIBCO/Invitrogen25300-054)

仪器

细胞电击管（Genepulsercuvette，0.4cm电极间隙；Bio-Rad165-2088或同级别的仪器）

电转化仪（GenePulserII和CapacitanceExtender;Bio-Rad)

细胞计数器

杂交箱（Model400H.I.;RobbinsScientific)

细胞培养箱（37°C，5%CO2)

倒置显微镜

尼龙膜（HybondN+;AmershamRPN303B)

PCR仪（GeneAmpPCRSystem2700,AppliedBiosystems)

PCR管（200jul;AppliedBiosystems)

微量移液器（P20和P200Pipetman)

培养皿风口纸（SealPlate;ExcelscientificSTR-SEAL-PLT)

泡沫塑料盒（大小可以装下96孔板）

组织培养皿（凝胶化的）

用3ml明胶溶液在室温下凝胶化培养皿（10cm,NUNCLONASurface;NUNC172958)

lh，弃掉多余的溶液。

组织培养板（96孔，平底，凝胶化）

5〇ul明胶溶液凝胶化Ih,吸出多余的溶液。

组织培养板（96孔，U形底）（NUNCLONASurface;NUNC163320)

37°C和55°C水浴

X射线片（BioMaxMS;Kodak8294985)

方法

制备和鉴定DNA

可以扩展F目的载体的边界构建一个对照载体，从而使检测重组所用
PCR引物被包括在内。

1.用合适的限制酶内切核酸酶消化的基因组/转基因克隆，得到我们感兴趣的DNA片段。

2•将DNA片段插入pflox载体的限制酶酶切位点，如果需要还可以采用平末端连接。

XteI和（或）SaH用于短臂的插人，JSaOTffl用于中等长度臂的插人，HindIII和（或）XZwI用于长臂的插人（图2A)。

3.用合适的限制性内切核酸酶（如Noil)切割载体成线性。

4•琼脂糖电泳鉴定质粒的浓度和质量。

5•将分离的线性载体储存在无核酸酶的TE缓冲液中。

胚胎干细胞的培养和电转化介导的基因转移

6•在凝胶化的组织培养皿上复苏并培养Rl或类似的胚胎干细胞。
每天更换培养液直到汇合度达到70%。

7.在电转化前4h更换培养液。

8•用PBS洗细胞，加人Iml胰酶-EDTA,37°C孵育5min。

9.轻轻振荡使细胞从培养皿上脱落；加人9ml培养液，轻轻吹打细胞，吹散细胞团，使细胞重悬。

10•细胞悬液转人一个50ml的离心管，190g离心5min。

11•吸出上清，将细胞重悬于30ml灭菌的冷PBS中。

12.用细胞计数器计算细胞的数量。

13.190g离心5min;吸出上清，将细胞重悬于灭菌的冷PBS中使细胞浓度达到每80〇ul悬液中含IO⁹个细胞。

14.将细胞悬液转人一个灭菌的细胞电击管中，与I0ug线性的载体混合；冰浴1〇min。

15_将电转化仪设置到如下参数：电压240V，电容500uF。将细胞电击管的电极面向连接器放置，传送电脉冲。

16.将细胞电击管放在冰上孵育lOmin。

17•将细胞稀释成不同浓度（每个培养皿〇.5X10⁶〜2X10⁶个细胞），培养24h。

18.为了进行阳性筛选，换成含200ul/mlG418的培养液进行培养。
1〜2d更换一次培养液，直到CU18抗性克隆长到2mm左右，一般需要7〜10d。

19•准备凝胶化的平底96孔板，向每孔加人150ul含G418的培养液；准备每孔含胰酶-EDTA的U形底96孔板。

20.将含有克隆的培养皿中的培养液换成PBS;将培养皿置于倒置显微镜下。

21.将20ul的移液器设置为10ul，吸取一个G418抗性的克隆，转移到含胰酶的96孔板中。

22.为另外的培养、冻存及制备DNA准备细胞。

为了避免冻存细胞的步骤，PCR检测必须用很少的细胞完成，还必须在原始平板（masterplate)中细胞融合前完成。

在原始平板中冻存细胞的步骤

a•用200ul移液器在约80ul胰酶-EDTA溶液中轻轻重悬细胞；将50ul的细胞悬液转到一个96孔板中[用于细胞培养和（或）冰冻的原始平板];将剩余的约30ul含胰酶-EDTA的细胞悬液转入凝胶化的平底96孔板中（用于制备DNA的复制平板，见后面），并加人150ul培养液；将原始平板和复制平板都放回培养箱中。

b•在含G418的培养液中培养细胞3〜5d。

这时原始平板中的大部分克隆可以冻存；继续培养复制平板中的细胞直到可以得到最髙的DNA产量，作为PCR的模板。

c•用灭菌PBS洗孔2次。

d•加人5〇M胰酶——EDTA，37°C孵育5min。

e.加人50ul冰冷的2X冻存液，用移液器轻轻吹打以重悬细胞。

f•加人100ul冰冷的矿物油。

g.用封口膜封住96孔板，放人泡沫箱中，移入一8〇°C冰箱。

从复制平板中制备DNA的步骤

a•用PBS洗复制平板，加人50ul的裂解缓冲液。

b•密封平板，55°C孵育2〜3h。

c.加入15〇4NaCl-乙醇溶液；室温孵育30min。

d.慢慢倾斜平板以倒出上清，或离心平板后轻轻吸出上清。

e•用200ul70%的乙醇洗孔3次，在实验台上干燥DNA。

f•向每孔加人30ulTE缓冲液，密封平板，37℃孵育过夜。

不冻存原始平板细胞，直接通过PCR筛选的步骤

当对照载体PCR检测的灵敏度足够高时，再检测目的克隆。

a.用200ul的移液器轻轻吹打含有胰酶——EDTA的复制平板中的细胞。

b.将细胞悬液转人一个无菌的15ml锥形离心管中，离心管中至少含有5ml的细胞培养液。

c•离心使细胞沉淀，吸出培养液。

d.用500ulPBS洗细胞，将细胞转人一个1.5ml离心管，离心使细胞沉淀；吸出PBS。

e.将细胞重悬于200ul高压过的双蒸水中，并马上放在干冰上。

f.煮沸5min，短暂离心以去除管壁上的水滴。

g.加入50jul蛋白酶K，55°C孵育至少5h(或孵育过夜）。

h.煮沸5min以使蛋白酶K失活。

23.将2〇ul用于PCR检测。

24.培养PCR阳性克隆，使细胞增殖。

25.通过基因组Southern杂交分析克隆的ZorP位点。

对于ZorP的基因组Southern杂交分析，选取一个或多个不包含于质粒DNA序列中的探针，同时选用ZorJ3探针（如分离的JNtoI酶切片段；见图2D)进行基因转染，以探测所有的ZmtJd位点的存在。作为替代方法也可以选择能够区别于等位基因片段的基因载体的限制酶酶切片段