培养细胞中RNA检测－NorthernBlot

1．制胶：（1％）

琼脂糖2.5g

10×Mops缓冲液25.0ml

H₂O192.0ml

2．在微波炉中加热煮沸使胶完全溶于水并灭菌。

3．取出胶冷却到60℃，于通风柜中加45ml甲醛，混匀。

4．加20μl溴化乙锭，混匀。

5．令胶液再冷却10分钟。

6．将其倒入四面封好的电泳槽中，加样品梳，约20分钟形成电泳凝胶。

7．加入1×Mops缓冲液于电泳槽，盖满胶表面，但不>1cm。

8．取10～15μgRNA样品，真空离心干燥，再溶于20μl载样缓冲液，加热95℃2分钟，使RNA变性。

9．每孔中20μlRNA点样，同时加一标准物。

10．一般35V电泳，从下午4pm～9：30am。

11．取出胶在紫外灯下观察，将刻度尺放在胶旁照像。成功的电泳在胶上28S（约5kb）18s（约2kb）处可见明显的溴化乙锭带。

12．用500ml10×SSC浸泡洗涤胶2次，每次20分钟，去除甲醛。

13．其它吸印步骤完全与SouthernBlot相同，只是吸印缓冲液为10×SSC。

14．室温下至少吸印12小时。

15．吸印完成后，取出胶与滤膜，表明加样起始部位、膜的方向及标号、用Whatman滤纸包好，80℃真空干燥2小时；如为尼龙膜在紫外灯下照射5分钟。

16．分子杂交：杂交原理与SouthernBlot相同，但所用杂交液及杂交、洗涤温度与之不同。预杂交液制备：

50％甲酰胺

1％SDS

1MNaCl

10％硫酸葡聚糖

17．将滤膜放入塑料袋，加入10ml预杂交液，去除气泡后封袋，在42℃水浴中振荡至少6小时。

18．制备变性鱼精DNA≥100μg/ml，变性同位素标记的探针（加入袋中的终浓度≤10ng/ml或1～4×10⁵dpm/ml）。

19．将此液0.5～1ml以针头注入含预杂交液的塑料袋中，排除气泡，从针眼处重新封死塑料袋，再用玻棒在袋上赶几次，使探针与预杂交液充分混匀，42℃振荡水浴6～42小时。

20．膜的洗涤：

a.2×SSC100ml室温中振荡5分钟，共2次。

b.1％SDS的2×SSC200ml60℃振荡30分钟，共2次。

c.0.1×SSC100ml室温振荡30分钟，共2次。

21.膜在室温中自然干燥后，用塑料纸包好即可进行放射自显影过程（同DNA检测）。