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酵母细胞核制备实验一差速离心法
蚂蚁淘
/发布时间:1630085406 /浏览量:256
| 实验材料 | 酵母菌 试剂、试剂盒 | 细胞核缓冲液Ficoll缓冲液 仪器、耗材 | 匀浆机
实验步骤 | 1. 将酵母菌接种于YPD培养基（100ml到20L），剧烈摇动或强制通气条件下培养至对数中期（OD600≈1~5）。培养物在预称重的离心瓶中于4℃，1500g离心5min。 2. 确定酵母细胞的湿重，它与压紧的细胞体积大致相同。在所有的后续步骤中菌体的量将当作1体积来考虑。 3. 细胞用2~4体积冰水重悬，并立即于4℃，1500g离心5min，加入1体积含30mmol/lDTT的酵母消解酶缓冲液重悬细胞、室温放置15min。 4. 于4℃，1500g离心5min，菌体用3体积的酵母消解酶缓冲液重悬。 5. 在每毫升原压紧细胞中加入2mg（200U）酵母消解酶-100T，于30℃水平摇床以大约50r/min的转速温育40min，通过水渗破法确定菌体是否完全转变为原生质体，如果原生质体化不完全，应继续温育直到完全。 6. 1500g离心原生质体5min，小心弃上清，原生质体球沉淀块不如细胞沉淀块般紧密。 7. 用2体积冰冷的酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，原生质体1500g离心5min，重复2次。 8. 用0.5体积的细胞核缓冲液重悬细胞。 9. 将细胞悬液逐滴加入盛有15~25体积冰冷的Ficoll缓冲液的烧杯中，此过程在冰浴或冷室中进行，不断地振荡。 10. 将悬浮液转移到离心管中，于4℃，3000g离心5min，如果要完全除去细胞碎片，重复离心几次。 11. 将上清转移至一个新的离心管中，于4℃12000g离心20min，沉淀用5~10倍体积的细胞核缓冲液重悬；再于4℃，12000g离心。 12. 为了获得细胞胞核裂解液，用1体积裂解缓冲液重悬细胞核沉淀。 13. 用2体枳酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，不要试图得到均一的悬液，只需将沉淀物从管壁上洗下来，悬转10~20次，于1500g离心10min回收原生质体。 14. 用玻璃棒仔细将原生质体沉淀重悬于1体积裂解缓冲液中。 15. 在Dounce匀浆器中用最紧密的研杵，冲击15~20次以裂解原生质体。 16. 往超离心管中加入一半管体积原生质体裂解液，再加等体积的抽提缓冲液，将离心管封口。于4℃在旋转轮或摇床上轻轻倒转离心管15~30min。 18. 取出几微升透析液，用水作1：1000稀释，测定电导率。如果和类似稀释度的贮存缓冲液相等或低于一定值时（通常100~250mmol/lNaCl），继续步骤19，否则继续透析。 19. 于4℃，10000g离心10min。收集透析液上清。分成小份放在液氮中冷冻，于-80℃贮存。
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