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细胞凋亡检测实验一荧光探针双标记法
mayitao
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| 实验方法原理 | 本实验用1μg/ml三尖杉酯碱HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。 细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。 |
|---|---|
| 实验材料 | 人早幼粒白血病HL-60细胞 |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、试剂准备 1. 三尖杉酯碱（HT）：300μg/ml； 2. Tris-HCl（pH7.5）：100mmol/L； 3. EDTA缓冲液：5mol/L； 4. 碱性裂解液：0.2mol/LNaOH； 5. 醋酸钠：3mol/LKAc（pH4.8）； 6. PI母液：500μg/ml； 7. Ho33342母液：2mmol/L； 8. 人早幼粒白血病HL-60细胞：用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2条件下培养。 9. 其他：异丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚蓝、蔗糖指示剂、TBE电泳缓冲液、1%琼脂糖、溴乙锭。 二、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡 1. 实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记①、②，每瓶含约6ml培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养。 2. 实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，①号瓶加入三尖杉酯碱200μl，使终浓度为1μg/ml，②号瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。 3. Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞 （1）染色：将瓶中的细胞摇匀取200μl于1.5ml的离心管中，加入Ho33342母液2μl，PI20μl，染色15分钟。 （2）滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。 |
| 注意事项 | 1. 诱导培养HL-60细胞时间要准确； 2. 荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。 |
| 其他 | 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNAladder（梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 |
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