(三)酶标记法

1.材料与试剂采用美国Oncor公司ApopTag^TM-Peroxidase试剂盒，包括：

⑴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体

⑵反应缓冲液

⑶TdT酶

⑷反应终止/洗涤液

⑸平衡缓冲液

⑹蛋白酶K消化液：20μg/ml蛋白酶K溶于PBS。

⑺30%H₂O₂

⑻DAB显色液：0.05%的diaminobenzidine(DAB)溶于PBS，用前过滤并加入

0.02%H₂O₂。

⑼甲基绿染液：0.5%甲基绿溶于0.1Mol/L枸橼酸钠，pH调整到4.0。

⑽塑料盖玻片及玻璃盖玻片

2．样品同荧光标记法。

3．操作方法

⑴固定：同荧光标记法。

⑵内源性过氧化物封闭玻片置于盛有0.5%H₂O₂缓冲溶液的染色缸内，室温下作用20min后，同荧光标记法洗涤。

⑶消化：玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸，室温下消化15min，洗涤

同上。

⑷平衡处理：将细胞或组织周围液体用吸水纸吸干，滴加平衡缓冲液（按70µl／cm²）覆盖细胞或组织表面，盖上塑料盖玻片，室温下作用5min～10min。

⑸反应：移去盖玻片，倾去平衡液，用吸水纸吸干周围液体，滴加反应液（按50µl/㎝²，18μlTdT酶36μl反应缓冲液），均匀覆盖在细胞或组织上，盖上塑料盖玻片，置于湿盒中，37℃温育1h。

⑹终止反应：移去盖玻片，将玻片置于盛有终止/洗涤液的染色缸内，37℃下洗涤30min（置摇床上振摇）。然后将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

⑺地高辛抗体反应：用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加70μl过氧化物酶标记的地高辛抗体，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下置于湿盒中，孵育30min。

⑻洗涤：置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

⑼用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加新鲜配制的DAB显色液，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下作用3min～6min。

⑽洗涤：置于蒸馏水中洗涤3次，每次3min～6min。

⑾套染：将玻片置于盛有甲基绿染液的染色缸中，室温染色10min。

⑿洗涤：蒸馏水洗涤3次（置于摇床上），每次2min。

⒀脱水、封片：100%正丁醇，3次，每次2min。二甲苯，3次，每次2min。

明胶甘油封片。

4．结果判定光学显微镜下观察，所有的细胞核均着绿色，凋亡的细胞核染色质显示出特异性的棕黄色。

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