凋亡检测操作流程 一、AnnexinV 检测凋亡细胞膜的改变 试剂及溶液： A．对于单独购买的试剂： a)10XBindingBuffer（货号：556454）：0.1MHEPES，pH7.4；1.4MNaCl；25mMCaCl2。使用前稀释至1X。 b)PropidiumIodide（PI，货号：556463）：建议与以下试剂同时使用AnnexinV-FITC（货号：556420,556419）或AnnexinV-Biotin（货号：556418，556417） c)Via-Probe™（货号：555816）：核酸染料7-AAD。建议与以下试剂同时使用AnnexinV-PE（货号：556422，556421）或AnnexinV-Biotin（货号：556418，556417）。 d)1XPBSBuffer（货号：554781）：8gNaCl,0.2gKCl,1.44gNa2HPO4·7H20,0.24gKH2PO4,加水至1L。调整pH值至7.2。高压灭菌室温保存。 B．对于凋亡检测试剂盒（货号：556547） a) FITCAnnexinV（组分编号：51-65874X）：每个样本5μl用量。 b) PropidiumIodide（PI，组分编号：51-66211E)）：现成的核酸染料。每个样本5μl用量。 c) 10XAnnexinVBindingBuffer（组分编号：51-66121E）：0.1MHepes/NaOH(pH7.4),1.4MNaCl,25mMCaCl2.使用时用双蒸水配制成1X。 操作步骤： 1．取Falcon试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。 2．使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1′BindingBuffer缓冲液制成1′106细胞/ml的悬液。 3．Falcon试管中加入100μl细胞悬液。 4．按以下体积加入AnnexinV与核酸染料： 管号         名称           荧光标记AnnexinV           核酸染料：1     阴性对照                -                        -2      单阳1              AV-FITC           -

3      单阳2         -            PI4      样本        AV-FITC                     PI

5．轻轻混匀，室温（20°C~25°C）避光处放置15分钟。 6．*使用AnnexinV-Biotin试剂进行检测时： h 1′BindingBuffer缓冲液洗细胞一次，去上清。 h 1′BindingBuffer缓冲液100μl溶解SAv-FITC试剂0.5μg，加入到细胞管中。 h轻轻混匀。加入5μlPI，室温（20-25°C）避光处放置15分钟。 7．各试验管中分别加入1′BindingBuffer缓冲液400μl。1小时内上流式细胞仪测定结果。AnnexinVBlocking  待测细胞与未标记的重组AnnexinV预孵育，然后进行实验，是AnnexinV细胞凋亡检测的质量控制。原理是预先阻断AnnexinV-FITC的结合位点，这样可以证明AnnexinV-FITC凋亡分析的特异性。 1. 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1′BindingBuffer缓冲液制成1′106细胞/ml的悬液。 2. 在5ml的培养管中加入100μl细胞悬液（约1′105个细胞）。 3. 加入5-15μg纯化的重组AnnexinV。注意，不同的细胞系，以及凋亡的不同阶段，其AnnexinV位点饱和所需要的纯化的重组AnnexinV含量不同。某些情况下，为达到最好效果，可以减少细胞数量，0.5′105个细胞加5-15μg纯化的重组AnnexinV。 4. 轻轻混匀，室温反应15分钟。 5. 加入5μl的AnnexinV-FITC或/和PI，轻轻混匀，室温避光处放置15分钟。 6. 各试验管中分别加入1′BindingBuffer缓冲液400μl。 7. 1小时内上流式细胞仪测定结果。