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Rapid Yeast Protein Prep for SDS PAGE and Western

蚂蚁淘  /发布时间:1628098202 /浏览量:183   

HorvathandRiezman,Yeast,1994;GottschlingLab

SampleBuffer:10ml
0.06MTris-HCl,pH6.80.6ml1MTris6.8
10%(v/v)glycerol2ml50%glycerol
2%(w/v)SDS2ml10%SDS
5%(v/v)2-mercaptoethanol0.5ml2-mercaptoethanol
0.0025%(w/v)bromophenolblue0.1mlSat.Bromphenolblue
4.9mlH2O

MakesampleBufferfreshbeforeuse.Canstorebufferfrozenat—20degreesfor~6months.

1.Growcellsovernight(~1x107cells/ml;A600=0.7)andcollect1.5mlcells(adjustvolumesaccordingtocelldensityofcultures)in1.5mlmicrofugetube(1minute,14000xg).Itisimportantnottogrowthecellstoahighdensityasthismethodwillnotworkwell.

10microlitersofasaturatedovernightcultureinYPDinnoculatedto5mlSD+essentialaminoacidsfor~16hrsgivesA600of0.5to1.0forwild-typecellsgrownat30degrees

150microlitersofYPDsaturatedculturedilutedto5mlYPDandgrownfor~5hrsat30degreesgivesanA600of~0.8forwild-typecells.

2.Washcells1Xwithwaterandcollectagainbycentrifugation.

3.ResUSPendcellsin100microliterssamplebuffer.

4.Heatat95degCfor5minutes.

5.Centrifuge14000xgfor5minutes.Load15microlitersperlaneonanSDSpolyacrylamidegel.

LastmodifiedFri,Aug11,2000

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