一、材料

1.缓冲液和溶液

NuclearFastRed

10%(体积分数）甲醛缓冲液(Polyscientific)

检测溶液（0.1mol/LTris-HCl、pH9.5，0.1mol/LNaCl)

DEPC处理的水

磷酸盐缓冲液（PBS)(137mmol/LNaCl，2.7mmolKCl,10mmol/LNa₂HPO₄)

2mmol/LKH₂P0₄，pH7.0,用于细胞培养物

二甲苯（用于组织样品）...

乙醇

牛血清白蛋白（BSA)，20g/L

SSC，20X(3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0)

NBT/BCIP显色剂(EnzoClinicalLabs)

2.酶和酶缓冲液

胃蛋白酶(2mg/ml)(EnzoDiagnostics)

配时加20mg的胃蛋白酶，9.5mlH₂O和0.5ml 2mol/LHCl

无RNA酶的DNA酶（BoehringerMannheim)

TaqDNA聚合酶Gold(AppliedBiosystems，FosterCity,CA)

RNA酶inhibitor(AppliedBiosystems)

DNA酶缓冲液，10X

配时加35ul的乙酸钠（3mol/L，pH3)、5ulMgS0₄(lmol/L)和60ulDEPC处理的H₂O。

3.核酸和寡核苷酸

地高辛标记的dUTP(BoehringerMannheim)，1mmol/L

4.抗体

抗地高辛的偶联物（antidigoxigeninconjugate)(BoehringerMannheim)

合适的PCR引物

5.专用器材

硅烷化的载破片（Ventana)

原位PCR仪（AppliedBiosystems)

聚丙烯薄片（polypropylenesheet)，用来作盖玻片（有高压消毒的袋装市售）

设定为37°C和60°C的培养箱

湿盒（垫有浸透水的纸巾的有盖的盒子）

6.其他

RT-PCR试剂盒（AppliedBiosystems)

这一试剂盒包括RT-PCR需要的缓冲液、核苷酸、RNA酶抑制剂、锰溶液、rTthDNA聚合酶以及对照引物。

石蜡包埋以及切片所需要的试剂和器材（用于组织祥品）

Permount

7.细胞和组织

合适的组织样品和细胞培养物

许多试剂包括蛋白酶、缓冲液、洗液、显色剂、探针和复染剂都包含在原位杂交的试剂盒中。现在许多生物公司出售该试剂盒。

二、方法

1.组织切片和细胞样品的准备

（1）将材料放入10%的甲醛缓冲液中固定8~15h，然后用石蜡包埋。

（2）如果是细胞培养物，直接将PBS加入到培养平板中清洗一次细胞。再加入10%的甲醛溶液，固定过夜，然后用乳胶刮刷将细胞从平板上刮下来。将收集的细胞在DEPC处理的H₂O中清洗两次，放入台式离心机中2000r/min离心3min。将细胞重悬于5mlDEPC处理的H₂0中，取50ul滴加在载破片上（最佳浓度：2500~7500个细胞），风干，室温保存。

（3）取至少3份4um厚的石蜡组织切片或3份细胞悬浮液至硅烷化的载坡片上，并使材料固定在载破片上。
硅烷化处理对细胞黏附是非常必要的。

（4）将组织切片在新鲜的二甲苯中放置5min除去石蜡，然后将其放入100%的乙醇，5min后取出，风干。

2.蛋白酶处理

（5）将制好的片子放入胃蛋白酶溶液中，37°C温育适当时间。

确定蛋白酶孵宵的时间见表19-1和表19-2.除胃蛋白酶外，其他的蛋白酶也可用作消化处理。详细信息参见19.2.1.2蛋白酶消化。

（6）将玻片放入DEPC处理的H20中lmin,以使蛋白酶失活，然后将其放入100%的乙醇中1min,取出，干燥。

这样简单的清洗步骤就足以除去/灭活胃蛋白酶，不需要加热灭活。

3.DNA酶处理（适用于逆转录酶原位PCR)



（7）在3张片子的2张上加lul10XDNA酶缓冲液、lul无RNA酶的DNA酶（10U/ul、8ulDEPC处理的H20。也可以选用RT/PCR的缓冲液代替10XDNA酶缓冲液。

（8）按照玻片上样品材料的大小将聚丙烯薄片（polypropylenesheet)裁成合适的尺寸，盖在所加的溶液上以防止其变干。将破片放入湿盒内，37°C温育。

（9）消化过夜后，移去盖片，将载坡片放入DEPC处理的H20中清洗lmin,然后放入100%乙醇中，取出，干燥。

4.反转录

（10）取一无菌的离心管，加入如下RT/PCR的试剂。

EZ缓冲液（AppliedBiosystems)                                                                                10ul

4种核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP,每种核苷酸的浓度均为10mmol/L)        各加1.6ul

牛血清白蛋白（200g/L)                                                                                             1.6ul

DEPC处理的H₂0                                                                                                       15.lul

MnCl₂(或者乙酸锰）溶液（10mmol/L)                                                                      12.4ul

正义引物（20umol/L)                                                                                                2.0ul

反义引物（20umol/L)                                                                                                 2.0ul

RNA酶抑制剂                                                        0.5ul

地高辛标记的dUTP(1mmol/L)                                                                                       0.6ul

rTth                                                                                                                                2.0ul

（11）将配好的RT/PCR的反应溶液加在经过DNA酶处理的2张破片中的1张上。

（12）为了防止变干，用一小滴指甲油将聚丙烯盖片固定在载玻片上，将载玻片放入一个铝「船」(aluminum「boat」）内，并在其上覆盖无菌的矿物油。然后放在热循环仪的模块(block)上，于60°C保温30min。
AppliedBiosystcms公司的Amplicover/Ampliclip方法可用来替代矿物油。

5.PCR



（13）将一无菌的离心管置于冰上，加入如下PCR反应试剂。

Taq聚合酶缓冲液（AppliedBiosystems)                                                                           5ul

dNTP溶液（每种核苷酸均为10mmol/L)                                                                        9.0ul

MgCl₂,25mmol/L                                                                                                             8.0ul

牛血清白蛋白，20g/L                                                                                                     1.6ul

H₂O                                                                                                                              22.4ul

正义引物（20umol/L)                                                                                                      2.0ul

反义引物（20umol/L)                                                                                                      2.0ul

Taq聚合酶Gold(10U/ul)                                                                                                 2.0ul

（14）在每一个样品上都加上PCR反应混合物，进行如下热循环反应。



（15）从载玻片上除去盖片和指甲油。在二甲苯中洗5min后放入100%的乙醇中5min，取出，风干。

6.检测

（16）将玻片放入含2g/LBSA的0.2XSSC中，60°C洗15min(适用于逆转录酶原位PCR)。
对做原位杂交PCR而言，如果使用至少80bp大小的全长基因组探针，就用上述洗液清洗。如采使用小于45bp的寡探针杂交，则用含20g/LBSA的1XSSC在45°C洗10min。

（17）除去残余的洗液，每张载玻片加100ul含地高辛抗体（按1:150稀释）的0.lmol/LTris-HCl，pH7,5，0.1mol/LNaCl溶液。37°C温育30min。

（18）用检测溶液洗玻片lmin，然后将其转入含有NBT/BCIP显色剂的检测溶液中，37°C溫育5~30min,在经销商的使用说明中有详细说明（EnzoClinicalLabs)。如果是直接将标记物掺入到扩增DNA中，则温育时间可短些；如果是使用探针检测，则温育时间要求长一些。将载玻片放在显微镜下镜检，当见到强烈的信号时终止反应。对原位杂交PCR而言，探针-扩增子复合物应当杂交15h;针对此目的推荐使用地高辛标记的探针。同时，在允许的情况下尽可能地使用最长的探针（最好80~100bp),这很重要。由于引物的低聚反应一般不会在原位杂交PCR中发生，因此可以使用包含引物区段的全长探针。同样，使用随机延伸的方法标记探针也很重要（Nuovo1997)。如果使用较短的探针，它们不得短于45bp,并且要采用3末端的方法标记(Nuovo1997)。

（19）将载玻片在水中清洗1min，用nuclearfastred复染5min，再在水中清洗1min，然后放入100%乙醇中lmin，二甲苯中lmin。用Permount封片，显微镜下观察。