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小鼠核转录因子p65(NF-kBp65)ELISA试剂盒

原理

本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗小鼠NF-kBp65单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的NF-kBp65与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠NF-kBp65，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，NF-kBp65浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中NF-kBp65浓度。

试剂盒组成（2-8℃保存）

准备试剂与收集血样

1.收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。

2.标准品液配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液。设标准管8管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

标本激活方法

1.将450ul标本稀释液加入到一支1.5ml进口聚丙烯管中,再加10ul血清或血浆标本。

2.加20ul1NHCI,盖紧，上下混匀。2－8℃放置60±2分钟。

3.加20ul1NNaOH,盖紧，上下混匀。

4.即用，或放-20/-70℃保存3天。计算结果时乘以稀释倍数50。（注意：不同的标本NF-kBp65的水平可能有较大差异，请根据实际情况灵活掌握稀释度）

5.细胞培养上清或组织匀浆10倍稀释(410ul的标本稀释液＋50ul样本＋20ul的1NHCI+20ul的1NNaOH)。

检测程序

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品（已激活）100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应NF-kBp65含量，再乘上稀释倍数即可。

试剂盒性能

1.灵敏度：最小的NF-kBp65检测浓度小于15pg/ml。

2.特异性：可同时检测重组或天然的小鼠NF-kBp65。不与小鼠其它细胞因子有交叉反应。

3.重复性：板内、板见变异系数均小于8.9％。

注意事项

1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。

2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。

3.板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。

4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。

5.本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！