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回复:时间:2018-01-28
(1)单抗包被-抗原-酶标二抗-底物显色。本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体,经洗涤后加入含有抗原之待测样品,如待检样品中有相应抗原存在,即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合,经保温孵育洗涤后,即可加入酶标记特异性抗体,再经孵育洗涤后,加底物显色进行测定,底物降解的量即为欲测抗原的量。(2)单抗包被-抗原-二抗-酶标二抗-底物显色。(改良双抗体夹心法)本法首先是将特异性抗体a包被于固相载体,经洗涤加入含有欲测抗原之待检样品。经孵育洗涤后再加一次未标记的特异性抗体b,而这次加入的抗体b于第一次包被于固相载体上的特异性抗体a对被测抗原来说都是特异性的,但不是用同种动物免疫制备的,否则可出现非特异性反应。经孵育洗涤后,再加酶标记抗b抗体,再经孵育洗涤后加底物显色进行测定。这种方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。因此,放大的倍数更高,故比双抗体夹心法更加灵敏。同时避免标记特异性抗体,而另一优点是只要标记一种抗抗体,即可达到多种应用。
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回复:时间:2018-01-30
双抗体夹心的意思是包被抗体-检测抗原-酶标抗体形成夹心结构。至于是单抗或者多抗都可以。如果是酶标二抗(二抗就是抗抗体)的话,一般是包被抗原-抗体-酶标二抗,这种是间接法的
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回复:时间:2018-02-03
ELISA操作步骤(双抗体夹心法) 1.包被过程(注意设置空白对照,阴性对照): 将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度,每孔抗原加入100μl,置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体,(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。 2.PBS洗3次,每次3分钟。 具体为:吸干或甩干孔内反应液;用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注板孔后,即甩去);浸泡,即将洗涤液注满板孔,放置1-2分钟,间歇摇动,浸泡时间不可随意缩短;吸干孔内液体,可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干;重复操作涤3次。 3.加入待检测样品(建立合适的浓度梯度): 检测时一般采用1:50-1:400的稀释度,应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。将稀释好的样品加入酶标反应孔中,每样品至少加双孔,每孔100μl,置于37℃,40-60min。 4.PBS洗3次,每次3分钟。 5.加入酶标抗体: 酶标抗体:根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度,37℃30-60min之间,短于30min往往结果不稳定,每孔加100μl。 6.PBS洗3次,每次3分钟。 7.加入底物液(现用现配): TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml底物缓冲液(PH5.5)10ml0.75%H2O232μl,底物加入量每孔100μl(TMB空白显色孔除外),置37℃避光放置20-25分钟。 8.终止反应: 每孔加入终止液50μl(2MH2SO4)终止反应,此时蓝色立转黄色,于20min内测实验结果。 9.结果判断: 可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅。也可测吸光值:在ELISA检测仪上,TMB反应产物检测需要450nm波长,检测时一定要首先进行空白孔系统调零。用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示,当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍,(数值的大小依具体检测要求而定)。展开
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