材料

无菌
准备冻存的细胞（如果是贴壁细胞：配制无菌PBSA和0.25%的粗胰蛋白酶）

生长培养基（血清能促进冷冻后细胞的存活；血清浓度可达50%，或用纯血清。如血清使用于不需要血清的细胞时，在复苏后应清洗掉。）

细胞保护剂，无杂志（见前）：二甲基亚砜保存于玻璃瓶中或聚丙烯管中，或新鲜准备的甘油，治愈普通容器中

注射器：1~5ml，用于分装甘油（有毒）

塑料小管，预先标记上细胞系的名称以及冻存日期

非灭菌

血细胞计数板或电子细胞计数器

储存管或支架（支架可能已经在冻存器中了）

冻存用的隔热容器：聚苯乙烯盒衬以脱脂棉，或泡沫塑料隔热管（图20.2；或使用可控制冷冻速率的冷冻箱，图20.5）

手套，腈制的

操作步骤

1.确保细胞满足冷冻标准（表20.1），肉眼及显微镜观察；

（a）外观健康（见13.6.1节）

（b）形态学特征（见16.4节）

（c）生长周期（应处于平台期前的对数生长晚期）（见（13.6.6节）

（d）无污染（见19.3节）

2.使细胞生长至对数生长晚期，若为贴壁细胞，用胰酶消化，并进行细胞技术（见方案13.2）。若为悬浮生长细胞，进行细胞计数并离心（见方案13.3）。

3.悬浮细胞的浓度为：2×10⁶个~2×10⁷个细胞/ml.

4.将以下任意一种细胞保护剂加入到生长培养基中，配制冻存液：

（a）加10%~20%的二甲基亚砜（DMSO）或（b）加20%~30%甘油。

安全提示

二甲基亚砜能穿透许多合成的或天然的膜，包括皮肤和橡胶手套[HoritaandWeber,1964]。因此，任何常用的具有潜在危险的物质（如致癌剂）均可能穿透皮肤，甚至能透过橡胶手套而进入血液循环。存在任何毒性的情况下，均应谨慎处理。

5.用冻存液将细胞悬液按1：1的比例稀释至细胞度浓约为1×10⁶~1×10⁷/ml,此时DMSO的浓度为5%-10%（或甘油浓度为10-15%）。建议勿将冻存管置于冰上，减少细胞退化。使用DMSO时，室温操作30min是无害的，当使用甘油时，则对细胞是有益的。

6.将细胞悬液分装至预先标记好的冻存管中，盖上盖子，拧紧，密封，注意不要太紧，避免螺旋扭曲变形。

7.将冻存管夹在铝条上，装入储存筒中（图20.2，20.6a，b，20.7a），或将其松散地排列在抽屉储存器中（图20.6c，d，20.7b~d）。

8.将冻存管通过上述方法（见20.3.4节）之一以1℃/min的速率进行冷冻。使用隔热保温的方法，使冻存管达到-70℃，若最初温度为20℃，则需4~6h（见图20.1，20.3.4节），但最好于-70℃过夜。

9.当冻存管温度达到-70℃或更低时，在将其从-70℃或能控制冷冻速率的冷冻柜中转移出来之前，检查冷冻记录，确定液氮罐中存放冻存管的合适位置。

10.将冻存管转移至液氮冷冻罐中，最好不要使其浸没在液氮中，将放油冻存管的铝条和纸质管放入预先确定的储存筒中，或将个别冻存管放入预先确定的抽屉中。该步骤必须迅速（＜2min），因为冻存管会以越10℃/min的速度升温，如果温度上升超过-50℃，细胞会迅速恶化。

安全提示

将冻存管放入液氮时，必须使用保护性手套和面罩。

11.冻存管安全地置于冷冻罐后，必须在冷冻目录中进行记录（表20.2和表20.3）