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酪氨酸激酶分析实验一基本方案
蚂蚁淘
/发布时间:1533519923 /浏览量:109
| 实验方法原理 | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 兔肌肉烯醇化酶 试剂、试剂盒 | 1mmolLDTT50mmolLHEPES（pH7.0）甘油100mmolL乙酸5×酪氨酸激酶反应缓冲液[γ-32P]ATP溶液冰2×SDS-PAGE样品缓冲液 仪器、耗材 | 30℃水浴和沸水浴
实验步骤 | 1.4℃最大速度离心5min相当于100μg兔肌肉烯醇化酶的样品，弃上清。 2.加10μl1mmol/LDTT/50mmol/LHEPES，pH7.0，充分混匀，冰浴30～60min。 3.加10ml甘油，混匀。如果后续实验在当天进行，可保持在冰浴中，否则-70℃保存。 4.临实验前加入20μl100mmol/L乙酸充分混匀，30℃水浴，5min。保存于冰浴中，直到进行下一步操作。 5.每个分析反应按以下比例将各反应组分加入1.5ml微量离心管中： 4μl5×酪氨酸激酶反应缓冲液 1μl酸变性的烯醇化酶（烯醇酶含量为2.5μg） 1μl[γ-32P]ATP溶液（ATP终浓度为5μmol/L，放射活性为5μCi/μl） 0～14μl水 盖好离心管，30℃水浴，10min。加入水的量取决于加入酶样品的多少。每个反应的容积为20μl。 6.加入1～14μl有酪氨酸激酶活性的酶样品开始反应。 7.30℃水浴温育10min。 8.加入20μl预冷的2×SDS-PAGE样品缓冲液停止反应，充分混匀，沸水浴3min，取20μl进行SDS-PAGE电泳分析。 注意事项 | 1.酸变性的烯醇酶在冰浴中不要超过1h。 2.步骤6中加入酶量的容积取决于样品中酶活性的大小。在预试验中所得的最大反应值可衡量磷酸转移反应的程度。在反应中为了保持磷酸基与底物的线性结合关系可适当减小酶的加量。 其他 |
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