一、材料与设备

1)垂直电泳装置

2)水浴

3)杂交管

4)杂交炉

5)用于从单链DNA模板制备单链DNA探针的试剂。①10X激酶缓冲液:400mmol/LTris-HCl(pH7.8),100mmol/LMgCL₂，1OOmmol/L疏基乙醇，250ug/ml牛血淸白蛋白储存于-20℃②[γ^-32P」ATP(比活度3000Ci/mmol)③合适的寡核苷酸：溶于蒸馏水，浓度为l0pmol/L,存于—20℃④PNK（polynuclemidekinase）：多核甘酸激梅，浓度为10U/ul,存于20°C.⑤10X复性缓冲液：100mmol/LTris-HCl(ph7.5).，l00mmol/LMgCl₂，500mnnol/LNaCl，10Ommol/LDTT⑥DNA模板：lmg/ml ⑦10XdNTP混合物：5mmol/LdATP、dCTP、dGTP、dTTP,.⑧KLenow片段：大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段，浓度为lOU/ul存于-20℃,⑨合适的限制性内切核酸酶。⑩6%聚丙烯酰胺/8mol/L尿素溶液(溶于0.5XTBE)及甲酰胺染料。⑪X射线胶片：需具有合适的灵敏度.⑫洗脱缓冲液：50mmol/LTrisHCl(PH7.5)，0.5mmol/LEDTA。⑬3mol/L乙酸钠(pH7.4)⑭tRNA:10mg/ml储存液，储存于-20°C

6)杂交和S1分析。①4X杂交缓冲液：1.6mmol/LNaCl，40mmol/LPIPES(pH6.4)。②去离子甲酰胺。③石蜡油。④S1缓冲液：300mmol/LNaCl30mmol/L乙酸钠(pH4.5);4.5mmol/L乙酸锌，⑤S1核酸酶：浓度为10U/ul，储存于-20℃。⑥S1终止缓冲液：2.5mol/L乙酸铵,50mmol/LEDTA⑦异丙醇


二、操作方法

(一）单链DNA探针的制备

1.由单链DNA模板制备单链DNA探针

1)寡核苷酸探针的标记：在0.5ml离心管屮加入下列组分:

寡桉苷酸                                          1ul

[γ^-32P]ATP                                     10ul

l0x激酶缓冲液                 2ul

dH₂O                                               6ul

多核苷酸激酶1ul

将上述组分混合，于37℃保温45min以标记寡核苷酸探针，最后于95℃保温2min以灭活多核苷酸激酶。

2)加入2ul笋链DNA模板，4ul10X复性缓冲液，14ulH₂O，依次在65℃10min，55℃lOmin，37℃lOmin保温

3)加入4ulNTP混合物，lulKlenow片段，室温作用10min后于65℃15min,灭活Klenow片段

4)加入适量的NaCl或通过稀释校正混合物的浓度，加人20U限制性内切核酸酶，37℃保温60min

5)加入2ultRNA储存液A1倍体积的3mol/L乙酸钠，3倍体积的乙醇5置于干冰中10min，12000g离心15min以沉淀样品

6)加入20ul甲酰胺染料重悬沉淀，于95℃加热上取样于6%聚丙烯酰胺/尿素凝胶h,至溴酚蓝达到凝胶底端时结束电泳。

7)凝胶用X射线感光片曝光5min，确定单链DNA片段的位置。切下相应的条带，置于500ul洗脱缓冲液中过夜。

8)加入50ul乙酸钠T20ugtRNA,lml乙醇。置于一20℃中2h,12000g离心20min

9)将沉淀作放射活性计数后重悬干甲酰胺中按lO5cmp/ul),储茌于一20°C。此探针剂吋用于杂交和S1分析

2.从双链DNA模板制备单链DNA探针

除下列步骤外,其余步骤均1「由单链DNA模板制备单链DNA探针"

1）先用所选的限制性内切核酸酶切割双链质粒（20ug)，沉淀重悬于水中，浓度为lmg/ml

2)复性步骤1「由单链DNA模板制备笮链DNA探针」屮第2)步需快速进行。加热灭活多核苷酸激酶后加入2〜5ug酶切质粒、、4ul10X复性缓冲液、14ul水。95°C保温5min，立即置于冰水屮，然后按步骤由单链DNA模板制备单链DNA探针」中第3)步进行。

3)省去限制性酶切，即1「由单链DNA模板制备单链DNA探针」中第4)步。

(二）杂交和S1核酸酶分析

1)于0.5mlEppendorf管中加入下列组分：

探针（共10000cpm)                                10ul

4X杂交缓冲液                     5ul

RNA(总poly(A)+RNA或离体合成的）     5ul

石蜡油(以防止蒸发）                            20ul

混勻于37℃保温4〜16h。

2)加200ulS1缓冲液(含S1核酸酶100U)，充分混匀，置于37°C中5〜30min。加入50ulS1终止缓冲液终止反应，并加入40ugtRNA，300ul异丙醇.置于干冰屮15min,12000g离心15min

3)用80%乙醇洗沉淀物，晾干后重悬于3ul甲酰胺染料中，95℃加热5min，上样于6%聚丙烯酰胺/尿素凝胶，电泳至溴酚蓝到达凝胶底端，将凝胶曝光8〜48h