反转录酶M-MLV使用说明（Promega）

1、产品简介

莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶（M-MLVRT）是一种RNA依赖的DNA聚合酶，能使mRNA（>5kb）转录为CDNA。M-MLVRT的RNaseH活性相对于禽成髓细胞瘤病毒反转录酶较弱，更适合用来反转录较长的mRNA。M-MLVRT应用于以RNA为模板合成cDNA的第一条链。

注意：M-MLVRT的延伸性要低于AMV反转录酶，因此要得到和用AMV反转录酶一样产量的cDNA需加入更多单位的M-MLV反转录酶。

2、使用方法

1）使用方法简介以用2?g总RNA为例。在无RNase离心管中，加入0.5?g引物至含总RNA的样品中，总体积不大于15?l。70℃，5分钟打开模板链形成的二级结构。立即放于冰上降温防止二级结构恢复，随后短暂离心使液体集中在离心管底。

2）加入以下成分到已退火后的引物-模板混合物中。

注意：不要改变引物的加入比率。

M-MLV5×ReactionBuffer5?l

dATP，10mM1.25?l

dCTP，10mM1.25?l

dGTP，10mM1.25?l

dTTP，10mM1.25?l

RecombinantRNasinRibonucleaseInhibitor25units

M-MLVRT200units

无核酸水至最后体积25l

3）轻轻混匀离心管，如果使用随机引物在37℃孵育60分钟，其他引物则42℃孵育。延伸温度在37～42℃之间最佳。

4）M-MLVRT用于合成cDNA的第一链。往后的合成则需要根据需要自行设计引物再次合成。

3、Buffer组成

M-MLVRT5×ReactionBuffer

250mMTris-HCl（PH8.3室温下）

375mMKCl

15mMMgCl2

50mMDTT

4、来源

大肠杆菌表达纯化

5、保存条件

-20℃保存。避免经常冻融

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