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各位大侠：小弟最近做个长片段的CDNA与T载体的连接，片段大小6.4K，载体选用的是pUC19和pGEMT-easy,反转录酶用的是RevertAidTirstStrandcDNASynthesisKit(#K1621)，CDNA第二链的扩增用的是LATaq。我是用纯病毒的RNA做模板，操作步骤严格按照说明做的，也曾经有一次获得过电泳图清晰显示的是全长6.4KB左右的片段，与载体连接，结果筛选到的几个克隆，插入的片段仅有2KB左右，奈何？可最近几次再用此反转录试剂盒却不能得到所需片段。在此，小弟想问问大家，你们是否遇到同样的问题，是如何解决的？所用的试剂（载体和酶的选择）和方法是什么，可以告诉后来者，共同进步吧。
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回复：时间：2008-01-16
我想主要是你的片段比较大，虽然如你所言，能够通过RT－PCR得到你要的片段。但筛选到的克隆通常仅有2kB左右。我认为这很可能是质粒的稳定性问题。我记得看过Epicentre公司和Lucigen公司的一些实验tipsandtroubleshooting之类的资料。这些公司的专家声称有一些DNA片段就是特别难以克隆，他们常常采用的措施是降低克隆质粒的拷贝数，使用transcription－free的质粒，比如lucigen公司就有这类质粒。当然，我没有用过这两家公司的任何产品，只是经常到他们的网页浏览，看看有什么新东西。我目前常用的克隆载体是Fermentas公司的CloneJET试剂盒，克隆3kB的片段的效率都很高，远远优于Takara公司的pMD18T－simple。以上意见仅供参考
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