蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB ）一Western印迹法相关交流-蚂蚁淘在线

实验材料

试剂、试剂盒

仪器、耗材

实验步骤

一、操作步骤：

1.蛋白样品制备

（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：

①倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

②每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

③按1ml裂解液加10μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

④每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

⑤裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

⑥于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）

⑦将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。

（2）组织中总蛋白的提取：

①将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

②加400l单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。

③几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

④裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（1）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

①将培养液倒至1.5ml离心管中，于2500rpm离心5min。

②弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。

③用枪洗干上清后，加100μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

④将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

2. 蛋白含量的测定

（1）制作标准曲线

①从-20℃取出1mg/mlBSA，室温融化后，备用。

②取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0 μg，2.5 μg，5.0 μg，10.0 μg，20.0 μg，40.0μg。

③按下表在各管中加入各种试剂。

	0 μg	2.5 μg	5.0μg	10.0μg	20.0μg	40.0μg
1mg/mlBSA	——	2.5μl	5.0μl	10.0 μl	20.0 μl	40.0 μl
0.15mol/LNaCl	100 μl	97.5 μl	95.0 μl	90.0 μl	80.0 μl	60.0 μl
G250考马斯亮蓝溶液	1ml	1ml	1ml	1ml	1ml	1ml

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