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诱饵蛋白特性鉴定实验一基本方案
蚂蚁淘
/发布时间:1533685085 /浏览量:198
| 实验材料 | 蛋白质 试剂、试剂盒 | CM培养基 仪器、耗材 | 水浴锅培养箱电转仪
实验步骤 | 一、lacZ激活试验 1. 采用标准的亚克隆技术，将编码目的蛋白质的DNA插入pEG202的多接头中，构建一个符合读框的融合蛋白。 2. 将下列组合的质粒，分别按“乙酸锂转化法”转化酵母菌EGY48。 （1）pBait+pSH18-34（实验组） （2）pSH17-4+pSH18-34（激活阳性对照组） （3）pRFHM1+pSH18-34（激活阴性对照组） 3. 将转化混合物涂布于Glc/CM-Ura-His省却成分培养基平板，于30℃培养过夜，选择含两种质粒的酵母菌。 4. 将上步获得的三种转化子（实验组，阳性对照和阴性对照组）分别各挑至少5或6个单菌落，并将毎个克隆划在一个Glc/CM-Ura-His 省却成分培养基的主平板上。 5. 将一块尼龙膜轻轻地放在含酵母菌的平板上，待其完全浸湿后取出，尼龙膜在空气中干燥5min，将沾有菌落的一面朝上，于-70℃冷冻10min。 6. 取一张浸泡在含1mg/mlXgal的1×Z缓冲液中的Whatman3MM滤纸，将尼龙膜置于其上，菌落面朝上。或者直接将尼龙膜放在盛有约2ml含1mg/mlXgal的Z缓冲液的培养血中，于30℃温育并现察克隆的颜色变化。 二、抑制试验 7. 将以下组合的质粒分别转化酵母菌EGY48 （1）pBait+pJK101（实验组） （2）pRS423+pJK101（抑制试验阴性对照组） （3）pRFHM1+pJK101（抑制试验阳性对照组） 8. 将每一种转化混合物涂布于Glc/CM-Ura-His省却成分培养基平板上，以便选择具有一对转化质粒的酵母菌细胞，于30℃培养直至菌落出现，通常需要2~3天，但不能超过4天。  图一、pEG202LexA-融合质粒 9. 转化后生长出来的单菌落划线在Glc/CM-Ura-His 省却成分培养基平板上，并于30℃培养过夜。 10. 通过液体检测试验（使用Gal/CM省却成分培养基），复印膜分析，或结合两种检测方法。检测3组转化酵母菌株中的β-半乳糖苷酸活性（实验组，阳性对照组，阳性对照组）。 三、LEU2试验 11. 取一个转化pBait和pSH18-34报道质粒的EGY48酵母菌单菌落，分散于500μl无菌水中，取出其中100μl稀释在1ml无菌水，并用无菌水作1/10倍比连续稀释至1000倍。 12. 从每一个稀释浓度各取100μl分别涂布Glc/CM-Ura-His 省却成分培养基平板和Glc/CM-Ura-His-Leu 省却成分培养基平板，于30℃培养过夜。 13. 选择能作为相互作用阱进行文库选择的克隆；合适的pBaits应不能激活lacZ和leuZ报道基因，要求产生的β-半乳糖苷酶活性比JK101+pRS423低，与JK101+RFHM1相当。pBaits具有较低的激活活性可能也适用的，如pBaits具很强的激活活性，应该加以截短。
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